人canstatin基因克隆及其重组蛋白的表达和纯化

• 作者: 何小平 屠振兴 李兆申 潘雪 金晶 高军 龚燕芳
• 来源期刊: 解放军医学杂志
• 学科: 医学
• 关键词: 基因,canstatin 血管生成 基因克隆 蛋白纯化
• 年，卷（期）: 2005,（7）
• 所属期刊栏目: 实验研究
• 页码范围: 634-637
• 页数: 4页
• 分类号: R73
• 字数: 4661字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3321/j.issn:0577-7402.2005.07.029

摘要

目的克隆人血管能抑素canstatin基因,构建其原核表达载体,表达并纯化出canstatin蛋白.方法从人胎盘组织中提取总RNA,经RT-PCR扩增出canstatin基因,克隆进质粒pUCm-T,将测序正确的目的基因片段插入质粒pET-22b(+)相应位点,转化E. coli BL21,IPTG诱导蛋白表达.超声破碎菌体,Ni-NTA柱亲和层析纯化重组蛋白.结果从人胎盘组织中提取总RNA,显示3条清晰条带,分别对应28S,18S,5S,分光光度计法测得总RNA浓度为1.8g/L; RT-PCR扩增出与预期目的基因canstatin长度一致的cDNA片段;构建出克隆质粒pUCm-T/canstatin,基因测序结果与GenBank公布的canstatin基因序列完全一致;构建出表达质粒pET-22b(+)/canstatin,BamH Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切鉴定证实构建正确;IPTG诱导蛋白表达,SDS-PAGE电泳分析表明在相对分子质量24kD左右出现新的蛋白表达条带,诱导后1h、2h、3h、4h表达蛋白占菌体总蛋白的百分比分别为18.2%、18.8%、23.0%和23.4%;诱导3h的菌体超声破碎后,Ni柱亲和层析,125、250mmol/L咪唑洗脱液SDS-PAGE电泳显示出清晰的单一条带.结论成功克隆出canstatin基因,成功构建了其原核表达载体,并且成功表达、纯化出canstatin蛋白,为进一步研究其临床应用打下基础.