结核分枝杆菌融合基因Hsp65-Esat6荧光表达载体的构建及表达

• 作者: 周曙光 姚翠婵 宋东 李君武 李晓栋 黄泽棋 黄清华
• 来源期刊: 中国组织工程研究与临床康复
• 学科: 医学
• 关键词: 结核分枝杆菌 Hsp65 Esat6 融合基因 DNA疫苗
• 年，卷（期）: 2007,（29）
• 所属期刊栏目: 技术与方法
• 页码范围: 5836-5839
• 页数: 4页
• 分类号: R378.9
• 字数: 1575字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3321/j.issn:1673-8225.2007.29.051

摘要

背景:Hsp65和Esat6之间的Linker编码一段疏水性多肽,其具有良好的柔顺性和折叠性,有利于翻译成融合蛋白时融合蛋白之间的空间折叠,使融合蛋白保持与两个天然蛋白空间构象的一致性,从而形成正确的构型而提高它们的免疫原性.目的:从结核分枝杆菌(MTB)H37Rv株中克隆目的融合基因Hsp65-Esat6,与报告基因EGFP一起构建真核表达载体pEGHsp65-Esat6,通过免疫组织化学法分别检测细胞中Hsp65蛋白和ESAT-6蛋白的表达.设计:单一样本实验.单位:暨南大学医学院微生物免疫学教研室.材料:质粒pVAE由华南理工大学曹以诚教授惠赠,MTBH37Rv株、大肠杆菌DH5α、表达质粒pEGFP-C1为本实验室保存,Hela细胞由本教研室胡萍博士惠赠.方法:实验于2005-09/2006-06在暨南大学医学院微生物与免疫教研室和中心实验室完成.以MTB全基因组为模板经聚合酶链反应(PCR)扩增出Hsp65基因(不含终止子),与pEGFP-C1载体进行重组,构建pEGHsp65(不含终止子)重组质粒.再以pVAE质粒为模板,经PCR扩增出Linker-Esat6基因,与pEGHsp65质粒(不含终止子)进行重组,构建真核表达载体pEGHsp65-Esat6.通过限制性内切酶图谱测定pEGHsp65-Esat6融合质粒大小;对质粒pEGFP-C1的多克隆位点内的DNA序列进行序列分析鉴定;将质粒转染Hela细胞,观察荧光的表达情况及转染效率,通过免疫组织化学法分别检测细胞中Hsp65蛋白和ESAT-6蛋白的表达.主要观察指标:①pEGHsp65-Esat6融合质粒大小.②pEGFP-C1DNA序列分析.③转染后Hela细胞的荧光表达情况.④细胞中Hsp65蛋白和ESAT-6蛋白的免疫组织化学结果.结果:①质粒pEGFP-C1的大小约为4.7 kb,而pEGHsp65为6.4 kb,融合质粒pEGHsp65-Esat6约为6.7 kb,在琼脂糖凝胶电泳图上可以分辨出泳动速度的差异.②结果与结核分支杆菌H37Rv株的Hsp65和Esat6的基因序列完全相同.③转染融合质粒24 h后,使用共聚焦显微镜可观察到有部分细胞表达荧光蛋白,说明融合质粒转染成功,转染率约为30%.未转染的Hela细胞则无荧光表达.④通过免疫组织化学法证实融合质粒在Hela细胞内能正确表达出具有生物学活性的Hsp65与ESAT-6蛋白.结论:采用Hsp65和Esat6搭配作为免疫原,成功克隆并构建了结核分枝杆菌融合基因Hsp65-Esat6荧光真核表达质粒.

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	李君武	暨南大学医学院微生物免疫学教研室	31	44	3.0	4.0
2	黄泽棋	暨南大学医学院微生物免疫学教研室	4	4	1.0	1.0
3	宋东	暨南大学医学院微生物免疫学教研室	6	9	2.0	2.0
4	姚翠婵	暨南大学医学院微生物免疫学教研室	1	1	1.0	1.0
5	周曙光	暨南大学医学院微生物免疫学教研室	4	5	1.0	1.0
6	李晓栋	暨南大学医学院微生物免疫学教研室	3	4	1.0	1.0