GFP/HBV X融合蛋白重组载体的构建及稳定表达细胞系的建立

• 作者: 吴盟 李刚 杨林 范红梅 谢奇峰 陈幼明 陈雪娟 高志良
• 来源期刊: 热带医学杂志
• 学科: 医学
• 关键词: 乙型肝炎病毒X蛋白 绿色荧光蛋白 重组体 细胞系
• 年，卷（期）: 2007,（2）
• 所属期刊栏目: 基础研究论著
• 页码范围: 112-115,125
• 页数: 5页
• 分类号: R512.6
• 字数: 3546字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.1672-3619.2007.02.004

摘要

目的 构建绿色荧光蛋白(GFP)与人乙型肝炎病毒(HBV)X基因的重组表达载体,建立稳定表达HBV X蛋白(HBx)与GFP融合蛋白的HepG2细胞系,以进一步研究HBx的生物学功能及其在肝癌发生中的作用.方法 应用PCR法从adr亚型HBV质粒Phbv DNA中扩增HBV X基因片段,PCR产物经HindⅢ和KpnⅠ双酶切后定向插入绿色荧光蛋白真核表达载体Pegfp-C1的相应酶切位点,转化宿主菌DH5α,采用上述双酶切及DNA测序鉴定重组质粒Pgfp-HBx;采用脂质体转染法将Pegfp-C1质粒、Pgfp-HBx重组质粒DNA转染人肝母细胞瘤细胞系HepG2细胞,G418选择抗性细胞克隆,荧光显微镜下观察GFP表达,挑取表达GFP的抗性克隆扩大培养、传代.采用RT-PCR检测转染细胞HBV X基因的表达.结果 经酶切及测序鉴定成功构建了GFP-HBV X重组表达载体Pgfp-HBx;将Pegfp-C1、Pgfp-HBx重组质粒转染HepG2,经G418筛选15d获得抗性细胞克隆.将带绿色荧光的抗性克隆细胞扩大培养并经传代70次,细胞仍表达强的荧光蛋白.RT-PCR检测表明转染Pgfp-HBx重组体的HepG2/GFP-HBx细胞有HBV X转录、表达.结论 成功构建了GFP-HBV X真核重组表达载体Pgfp-HBx;获得了稳定表达GFP-HBx融合蛋白的HepG2细胞系.这为进一步研究HBx的生物学功能以及HBx在肝癌发生中的作用与机制打下了基础.