构建PSMA shRNA慢病毒载体转染293T细胞后PSMA mRNA和蛋白的表达变化

• 作者: 尹心宝 李海源 杜涛 江春 许可慰 郭正辉 韩金利 黄健 黄海
• 来源期刊: 中国病理生理杂志
• 学科: 医学
• 关键词: 前列腺特异性膜抗原 前列腺肿瘤 RNA干扰 293T细胞
• 年，卷（期）: 2008,（10）
• 所属期刊栏目: 论著
• 页码范围: 1886-1890
• 页数: 5页
• 分类号: R737.25
• 字数: 3991字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3321/j.issn:1000-4718.2008.10.004

摘要

目的:利用基因工程技术筛选获得阻断前列腺癌细胞株LNCaP中前列腺癌特异性膜抗原(PSMA)表达的shRNA序列,并构建慢病毒载体.观察转染前列腺癌细胞后对PSMA mRNA和蛋白表达的影响.方法:根据PSMA基因信息,设计siRNAI、siRNA2、siRNA3三条针对PSMA 基因cds 区的siRNA序列,组建shRNA对应的4对互补的单链DNA,包括siRNA的正义链和反义链;正义链序列按5'向3'顺序依次为:酶切位点(BamHI)、干扰序列(19 bp)、loop环(TTCAAGAGA)、干扰序列的反向互补序列(19 bp)、终止信号(TTTTT)、酶切位点(EcoR I).将合成的序列插入空载体pSIHI-H1-copGFP shRNA vector中,转染前列腺癌细胞后,通过real-time PCR检测对PSMA mRNA表达,通过Western blotting检测PSMA蛋白的表达.结果:设计的3条针对PSMA的序列中第2条的抑制效果最好,目的序列位于PSMA(NM_004476)的1207到1226,茎环序列为5'-GATCC GTCTCAAAGTGCCCTACAA TTCAAGAGA TTGTAGGGCACTTTGAGAC TTTTT G-3'.其对前列腺癌细胞株中PSMA mRNA表达的抑制率为60%,对PSMA蛋白表达的抑制率为86%.转染细胞后,细胞可以稳定低表达PSMA.结论:成功获得阻断前列腺癌细胞株LNCaP PSMA表达的shRNA序列,并构建慢病毒载体,pSIH-PSMA-siRNA2转染前列腺癌细胞后对PSMA mRNA表达的抑制率为60%,对PSMA蛋白表达的抑制率达86%.为后期研究PSMA在前列腺癌发病中的作用机制以及免疫导向治疗等提供了实验基础.