九个苯丙氨酸羟化酶基因单点突变重组质粒的构建和鉴定

• 作者: 宋昉 王红 白晋丽 瞿宇晋 金煜炜
• 来源期刊: 解放军医学杂志
• 学科: 医学
• 关键词: PAH基因 点突变 质粒
• 年，卷（期）: 2008,（5）
• 所属期刊栏目: 实验研究
• 页码范围: 527-530
• 页数: 4页
• 分类号: R34-33
• 字数: 3404字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3321/j.issn:0577-7402.2008.05.015

摘要

目的 构建Y154H、R157I、Y206C、G247R、D282G、G346R、S349A、A389G、R400K 9个PAH基因突变型重组质粒,为下一步研究这些PAH突变体在哺乳动物细胞中表达蛋白功能奠定基础.方法 [1]选择错义突变位点.结合突变位点所在酶蛋白的结构域(如催化结构域或与辅因子BH4结合位点)及患儿相关临床表型进行了9个突变位点的选择.[2]构建PAH基因突变型重组质粒.以野生型PAH真核表达载体pcDNA3.0-PAH-wt为模板,应用Primer Premier 5.0软件自行设计了9对突变引物,并在Platinium Taq DNA高保真聚合酶的作用下直接利用体外PCR定点突变法构建PAH基因突变型重组质粒.[3]初筛PAH基因突变型重组质粒.氨苄抗性初步筛选:利用重组基因含氨苄青霉素抗性基因的特点,可筛选出阳性克隆;CR及酶切技术筛选:根据野生型与突变型靶序列酶切片段的差异进行筛选,其中S349A、D282G、G247R、Y206C、Y154H这5种突变存在Mva Ⅰ、MvaⅠ、Hind Ⅲ、RsaⅠ、RsaⅠ的天然酶切位点,而R157I、G346R、A389G、R400K与其相应的野生型所在位点周嗣并不存在天然的酶切位点,需要在目的 位点的上/下游设计引物,即人工构建DdeⅠ、Hind Ⅲ、PstⅠ、MvaⅠ酶切位点,然后利用上述限制性内切酶进行突变体的酶切鉴定.[4]验证PAH基因突变型重组质粒,突变体最终由DNA测序加以验证.结果 这9个突变型PAH cDNA序列除特定碱基位点被突变的碱基替换外,其他序列和野生型的完全保持一致.结论 成功构建了9个PAH基因突变型重组质粒.体外定点突变技术准确、实用.

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	金煜炜	首都儿科研究所遗传室	27	168	8.0	11.0
2	瞿宇晋	首都儿科研究所遗传室	24	100	6.0	8.0
3	王红	首都儿科研究所遗传室	30	182	8.0	11.0
4	白晋丽	首都儿科研究所遗传室	16	62	6.0	6.0
5	宋昉	首都儿科研究所遗传室	47	241	8.0	12.0