葡萄糖调节蛋白75基因突变体及其真核表达载体构建

• 作者: 刘晓宇 刘雯 左伋 杨玲 郭纬纬
• 来源期刊: 生理学报
• 学科: 生物学
• 关键词: 葡萄糖调节蛋白75 缺失突变 真核表达载体 细胞活力
• 年，卷（期）: 2009,（6）
• 所属期刊栏目: 研究论文
• 页码范围: 533-538
• 页数: 6页
• 分类号: Q2-33
• 语种: 中文

摘要

葡萄糖调节蛋白75(glucose-regulated protein 75,Grp75)与细胞内的p53结合抑制其核移位,起到了保护细胞的作用.为研究Grp75和p53的结合与否是如何影响细胞活力,现构建Grp75缺失突变基因的真核表达载体.以SOE-PCR(genesplicing by overlap extension)法得到Grp75缺失突变基因,与pcDNA3.0真核表达载体连接,构建Grp75缺失突变的特异性表达载体pcDNA3.0/Grp75(△253-282),经酶切、测序鉴定Grp75缺失突变蛋白表达载体成功构建.用脂质体将pcDNA3.0/Grp75(△253-282)转染到PC12细胞株,以1 mg/mL浓度的G418筛选出稳定株,并命名为PC12/Grp75(△253-282)(+).半定量RT-PCR和Western blot结果显示PC12/Grp75(△253-282)(+)细胞组内Grp75的mRNA和蛋白的表达水平较PC12细胞组增高.对PC12细胞组、PC12/Grp75(△253-282)(+)细胞组和PC12/Grp75(+)细胞组(pcDNA3/Grp75真核表达载体已构建)分别缺糖0 h、3 h、9 h、18 h和36 h,MTT法检测各组细胞活力,Hoechst33324法检测细胞凋亡情况.结果显示PC12/Grp75(+)组细胞活力高于其它两组,PC12/Grp75(△253-282)(+)组高于PC12组,差异有统计学意义.Hoechst33324染色后,凋亡细胞的比率与MTT细胞活力检测结果基本一致.Western blot检测三种细胞内p53的表达量,PC12/Grp75(+)细胞内p53蛋白表达量低于另外两组,可能是由于Grp75蛋白量的增多部分抑制了p53的表达,提示Grp75对缺糖诱导细胞凋亡的抑制作用部分与p53的结合有关.以上结果表明Grp75基因的缺失突变在一定程度上降低了细胞的活力.

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	杨玲		19	20	3.0	4.0
2	刘晓宇		9	4	1.0	2.0
3	刘雯		51	340	10.0	18.0
4	左伋		67	264	9.0	13.0
5	郭纬纬		3	2	1.0	1.0