构建胶质原纤维酸性蛋白原核表达载体及蛋白表达鉴定

• 作者: 于明琨 侯立军 卢亦成 吕立权 曹鹏 王爽 胡国汉 陈怀瑞 骆纯 齐向前
• 来源期刊: 中国组织工程研究与临床康复
• 学科: 医学
• 关键词: 胶质原纤维酸性蛋白 质粒 真核表达载体
• 年，卷（期）: 2009,（15）
• 所属期刊栏目: 技术与方法
• 页码范围: 2923-2926
• 页数: 4页
• 分类号: R349.83
• 字数: 4646字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.1673-8225.2009.15.026

摘要

背景:胶质原纤维酸性蛋白在神经损伤的发生发展过程中具有重要作用.目的:对胶质纤维酸性蛋白进行基因克隆,构建原核表达质粒并加以鉴定.设计、时间及地点:单一样本观察,于2008-09/1 1在上海市长征医院神经外科实验室完成.材料:中间载体pGEM-T Easy质粒购于Promega公司,原核表达质粒pGEX-4T-2由上海市长征医院神经外科实验室保存.方法:从人脑胶质瘤组织提取mRNA,采用反转录一聚合酶链反应的方法扩增胶质纤维酸性蛋白序列并表达,然后与载体pGEX-4T-2连接,转化宿主菌BL21构建重组质粒,诱导表达后纯化,Westem-blot鉴定.主要观察指标:总RNA鉴定结果,聚合酶链反应扩增产物分子质量的鉴定,重组表达载体的酶切鉴定,Western-blot鉴定.结果:抽提肿瘤组织总RNA后,电泳清晰可见rRNA28S、18S、5S 3条带.且总RNA的A260nm/A280nm值为1.903.聚合酶链反应结果显示,在约1 300 bp左右有一条特异性条带,与预期的胶质原纤维酸性蛋白基因大小一致.重组表达载体的酶切鉴定及测序结果与GenBank的胶质原纤维酸性蛋白序列一致,经Western-blot验证为目的蛋白.结论:用双酶切、DNA测序与Western.blot的方法证实原核表达载体构建成功.