SM22启动SCAP真核表达质粒的构建及其在CHO细胞中的表达

• 作者: 崔静 王媛媛 胡接力 阮雄中 陈压西 黄爱龙
• 来源期刊: 生物工程学报
• 关键词: SM22 启动子 SREBP裂解激活蛋白 质粒构建 基因表达 转染
• 年，卷（期）: 2010,（1）
• 所属期刊栏目: 生物技术与方法
• 页码范围: 114-120
• 语种: 中文

摘要

为建立平滑肌特异的固醇调节元件结合蛋白(SREBP)的裂解激活蛋白(SCAP)超表达的转基因小鼠,深入探讨SCAP的功能,本实验构建了由平滑肌特异蛋白SM22启动子(pSM22)启动仓鼠SCAP443位点突变体--SCAP(D443N)的真核表达质粒,并在仓鼠卵巢细胞(CHO)验证其表迭.利用巢式PCR从小鼠肝脏组织提取的基因组中扩增得到pSM22基因.先将其插入pMD-T载体,构建T-SM22,对pSM22测序后,通过双酶切将pSM22克隆到pGL3-control-Luc中,成为pGL3-SM22-Luc.转染pGL3-SM22-Luc到血管平滑肌(VSMCs)中,通过检测荧光素酶(Luc)值观察pSM22在VSMCs内的启动活性.利用PCR从pTK-HSV-SCAP(D443N)质粒中扩增出SCAP(D443N)后克隆入pGL3-control中,成为pGL3-SCAP,然后再将pSM22克隆入pGL3-SCAP中,成为表达质粒pGL3-SM22-SCAP(D443N).转染表达质粒到CHO细胞,用real-time PCR和Western blotting验证SCAr(D443N)的表达.结果证实pSM22在体外VSMCs中能启动Luc的表达;表达质粒pGL3-SM22-SCAP(D443N)酶切及测序结果正确;将其转染到CHO细胞后,与转染pGL3-control的对照细胞相比SCAP(D443)mRNA和蛋白表达显著增强.