构建携带增强型绿色荧光蛋白报告基因的重组反转录病毒表达载体pLXSN-Kozak-EGFP及鉴定

• 作者: 刘冠达 杨天燕 王乃平 王劲 韦锦斌
• 来源期刊: 中国组织工程研究与临床康复
• 学科: 医学
• 关键词: 增强型绿色荧光蛋白 报告基因 反转录病毒 载体 基因重组
• 年，卷（期）: 2010,（37）
• 页码范围: 6908-6912
• 分类号: R318
• 字数: 5080字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.1673-8225.2010.37.016

摘要

背景:增强型绿色荧光蛋白作为报告基因可在活细胞中表达发光蛋白.研究表明通过促进表达增强的Kozak序列可促进基因编码的蛋白质在真核细胞中的表达.目的:构建含增强型绿色荧光蛋白报告基因EGFP与促进表达增强的Kozak序列的pLXSN-Kozak-EGFP重组反转录病毒表达载体,并对此重组载体进行鉴定.方法:用聚合酶链反应方法从含增强型绿色荧光蛋白基因的表达载体pEGFP-N1上高保真克隆出EGFP基因,通过分子克隆技术将目的基因重组至反转录病毒表达载体pLXSN.用菌斑快速聚合酶链法筛选阳性重组子,针对目的基因插入载体的方向设计鉴别插入方向的引物,用聚合酶链反应法、限制性酶法鉴定目的基因及连接的正向性,并对pLXSN-Kozak-EGFP重组载体进行DNA测序分析.结果与结论:从pEGFP-N1载体中克隆出上游含Kozak序列的EGFP基因,目的条带大小约750 bp.构建的pLXSN-Kozak-EGFP重组子经菌落PCR鉴定,750 bp处有特异性条带.插入方向经PCR鉴定,350 bp处有特异性条带.限制性内切酶法鉴定,750与6000 bp处有特异性条带.DNA测序比对结果表明克隆的目的基因与Kozak-EGFP一致性为100%.结果提示实验成功构建了含EGFP报告基因与促进表达增强的Kozak序列的pLXSN-Kozak-EGFP重组反转录病毒表达载体,且插入方向为正向.

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	韦锦斌	广西医科大学实验中心	68	379	11.0	17.0
2	王乃平	广西中医学院药理学教研室	84	1132	18.0	31.0
3	杨天燕	广西医科大学第一附属医院药剂科	31	80	5.0	7.0
4	王劲	广西医科大学第一附属医院药剂科	18	57	4.0	6.0
5	刘冠达	广西中医学院药理学教研室	4	14	3.0	3.0