版纳微型猪近交系TNF-α基因mRNA实时荧光定量PCR检测方法的建立

• 作者: 刘丽仙 曾养志 李颖 潘伟荣 赵跃 霍海龙 霍金龙
• 来源期刊: 中国实验动物学报
• 学科: 生物学
• 关键词: 版纳微型猪近交系 实时荧光定量 TNF-α基因 GAPDH基因 基因表达
• 年，卷（期）: 2011,（2）
• 所属期刊栏目: 研究报告
• 页码范围: 153-160
• 分类号: Q95-33
• 字数: 5157字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.1005-4847.2011.02.015

摘要

目的 快速、灵敏、可靠的检测与临床多种疾病密切相关的重要基因TNF-α的表达情况,构建TNF-α基因及内参GAPDH基因荧光定量PCR质粒标准品.方法 利用版纳微型猪近交系4～6月龄猪建立动物模型,提取皮肤创面总RNA,设计特异引物.进行RT-PCR扩增.纯化目的片段与pMD18-T载体连接,转化宿主菌DH5α,提取重组质粒DNA,并经酶切、PCR和测序鉴定,计算重组质粒原液拷贝数浓度并制备梯度浓度标准品,进行实时荧光定量PCR,生成标准曲线.结果 建立的TNF-α基因和GAPDH内参基因mRNA表达实时荧光定量PCR检测方法灵敏度分别可达10<'3>和10<'5>拷贝,线性范围分别为10<'3>～10<'9>和10<'5>～10<'9>拷贝,阈值循环数(Ct)与PCR体系中起始模板量的对数值之间存在的线性关系R<'2>分别为0.993和0.999,扩增效率E分别为111.073%和95.948%.结论 成功的构建了版纳微型猪近交系TNF-α基因质粒标准品和标准曲线,并用内参基因GAPDH进行校正,此方法可为探讨TNF-α基因在临床多种疾病中所发挥的分子机理奠定基础.

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	刘丽仙	云南农业职业技术学院畜牧兽医系	44	160	7.0	10.0
2	霍金龙	云南农业大学云南省版纳微型猪近交系重点实验室	70	426	11.0	15.0
3	霍海龙	云南农业职业技术学院畜牧兽医系	16	62	5.0	7.0
4	潘伟荣	云南农业大学云南省版纳微型猪近交系重点实验室	24	126	7.0	11.0
5	李颖	昆明医学院第二附属医院整形外科	15	127	6.0	11.0
6	赵跃	云南农业职业技术学院畜牧兽医系	9	9	2.0	2.0