重叠延伸PCR法合成EV71VPl-LTB融合基因及其原核表达

• 作者: 姜柯安 李世彬 李江 贺志良 马永平
• 来源期刊: 中国微生态学杂志
• 学科: 医学
• 关键词: 人类肠道病毒71型vp1 大肠埃希菌不耐热毒素B亚单位 融合表达 重叠延伸PCR
• 年，卷（期）: 2011,（5）
• 所属期刊栏目: 论著
• 页码范围: 385-389
• 分类号: R373.25
• 语种: 中文

摘要

目的 用重叠延伸PCR(overlap extension PCR)法获得人肠道病毒71型vp1与大肠埃希菌不耐热肠毒素B亚单位(ltb)的融合基因,构建EV71 VP1-LTB融合表达质粒并在原核系统表达.方法 设计14对引物通过重叠延伸PCR技术合成vp1基因,以ETEC(44815)质粒DNA为模板,PCR扩增ltb基因,将vpl基因与ltb基因连接并测序,连接产物插入原核表达质粒pBEX,构建重组质粒pBEX-VP1-LTB,转化E.coli B1221(DE3)进行表达,SDS-PAGE及Western blotting分析其表达.电转法将重组质粒转入双歧杆菌.结果 合成的vp1基因全长891 bp,测序结果与预期相符,重组表达质粒pBEX-VP1-LTB经PCR及双酶切鉴定,表明构建正确;目的 蛋白在E.coli BL21(DE3)中获得了表达,Western bloting分析结果表明该蛋白具有与EV71 VP1抗体的反应原性;电转法成功将重组质粒转入双歧杆菌.结论 应用重叠延伸PCR技术成功构建了EV71 VP1-LTB融合表达质粒,并在E.coli BL21(DE3)中获得有生物学功能的VP1表达产物,重组质粒双歧杆菌转化及VP1-LTB融合蛋白的表达研究,为研制EV71分子内佐剂疫苗打下了基础.