神经生长因子β腺相关病毒穿梭质粒的构建和鉴定

• 作者: 党晓谦 李若飞 杨雷刚 涂忠民 王坤正 高大龙
• 来源期刊: 中国修复重建外科杂志
• 关键词: 神经生长因子β 腺相关病毒 穿梭质粒 脊髓损伤 基因治疗
• 年，卷（期）: 2012,（2）
• 所属期刊栏目: 干细胞与组织工程
• 页码范围: 172-176
• 页数: 5页
• 语种: 中文

摘要

目的 构建能够表达神经生长因子β (nerve growth factor β,NGF-β)的重组腺相关病毒(adenoassociated virus,AAV)穿梭质粒,为进一步包装AAV奠定基础. 方法 利用高保真酶分别扩增pAAV-多克隆位点(multiple cloning site,MCS)的结构元件和pGenesil-1.1的功能元件,连入T-easy载体,限制性核酸内切酶酶切并回收目的片段,DNA连接酶连接,得到含U6和CMV双启动子的重组AAV穿梭质粒pAAV-U6/CMV-增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP),用该质粒转染293细胞,观察有无绿色荧光表达；培养人Miapaca-2细胞,提取总RNA,进行RT-PCR得到NGF-β基因,插入T-easy载体,得到T-easy-NGF-β;将NGF-β插入pAAV-U6/CMV-EGFP,构建NGF-β重组AAV穿梭质粒pAAV-U6/CMV-NGF-β,将该质粒送基因测序. 结果 双酶切pAAV-U6/CMV-EGFP可见4 250、800 bp条带,质粒转染293细胞后可见绿色荧光表达；质粒T-easy-NGF-β双酶切可见3 015、736bp条带,测序显示基因序列正确；双酶切pAAV-U6/CMV-NGF-β可见4 250、736 bp条带；质粒pAAV-U6/CMV-NGF-β测序显示载体中的基因序列正确. 结论 成功构建NGF-β重组AAV穿梭质粒,为进一步深入研究脊髓损伤的基因治疗提供了实验基础.