NEP1-40基因慢病毒载体构建及鉴定

• 作者: 刘浩 刘立岷 周春光 孔清泉 宋跃明 袁海峰 龚全
• 来源期刊: 中国修复重建外科杂志
• 关键词: NEP1-40 神经再生 慢病毒载体 293T细胞
• 年，卷（期）: 2012,（2）
• 所属期刊栏目: 干细胞与组织工程
• 页码范围: 177-181
• 页数: 5页
• 语种: 中文

摘要

目的 构建NEP1-40 (Nogo extra cellular peptide residues 1-40)基因慢病毒表达载体,为后续转染目的细胞奠定基础,并实现在细胞中高效、稳定表达. 方法 从含有NEP1-40基因的cDNA文库中,利用PCR方法钓取NEP1-40基因编码区片段.将目的基因与酶切线性化的载体pGC-FU进行定向连接,其产物转化细菌感受态细胞.对长出的克隆先进行菌落PCR鉴定,再对PCR鉴定阳性的克隆进行测序和比对分析,比对正确的克隆即为构建成功的目的质粒.将构建成功的目的质粒和两种辅助包装质粒共转染293T细胞,包装成慢病毒,荧光显微镜下观察慢病毒转染293T细胞后荧光表达情况,采用Western blot检测NEP1-40及绿色荧光蛋白融合蛋白表达情况. 结果 PCR产物经电泳分析表明成功获取NEP1-40基因cDNA克隆,测序提示慢病毒转染质粒连接构建正确；荧光表达检测显示293T细胞中产生慢病毒颗粒；Westem blot显示NEP1-40在细胞内稳定表达. 结论 成功构建NEP1-40基因慢病毒表达载体,为后续转染目的细胞后从分子水平探讨NEP1-40基因功能奠定了实验基础.