反转录病毒载体介导的猪APOBEC3F在猪源细胞PK15中的表达

• 作者: 吴健敏 孙宇 张念 章金刚 罗佳 陆芹章 马玉媛
• 来源期刊: 生物技术通讯
• 学科: 生物学
• 关键词: 猪载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽样蛋白3F 反转录病毒载体 假型病毒 真核表达
• 年，卷（期）: 2012,（5）
• 页码范围: 686-689
• 分类号: Q78
• 字数: 3345字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.1009-0002.2012.05.015

摘要

目的:利用反转录病毒载体构建猪载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽样蛋白(APOBEC)3F重组质粒,并实现其在猪肾细胞PK15中的表达.方法:用RT-PCR方法扩增五指山猪来源的外周血淋巴细胞APOBEC3F基因,将其定点插入反转录病毒载体pMSCV neo中,同时于插入位点两侧分别添加FLAG和GFP标签,构建重组质粒pMSCV-FLAG-A3F-GFP,并进行酶切、测序鉴定;将鉴定正确的重组质粒与pVSV-G、pGag-Pol共转染包装细胞HEK293T,分别于转染后48~72 h收集细胞的培养上清以获得假型病毒粒子;用该假型病毒感染猪源细胞PK15,通过PCR、Western印迹检测目的基因的整合及表达.结果:PCR扩增到1254 bp的猪APOBEC3F基因,重组质粒pMSCV-FLAG-A3F-GFP经酶切、测序,结果无误;3质粒共转染HEK293T细胞包装出的假型病毒感染PK15细胞后观察到GFP表达;从感染假型病毒的PK15细胞基因组中扩增到1254 bp的猪APOBEC3F基因,Western印迹检测到78.1×103的猪APOBEC3F蛋白的表达.结论:实现了反转录病毒载体介导的猪APOBEC3F在猪源细胞PK15中的整合与表达,为深入研究该分子对猪内源性反转录病毒(PERV)的抑制作用奠定了基础.