构建定向T载体用于基因克隆和表达

• 作者: 严红 余晓岚 杨登想 翟超 蒋思婧 钟星 陈亮 马立新
• 来源期刊: 生物工程学报
• 关键词: TA克隆 PCR克隆 重组子筛选 蛋白质表达
• 年，卷（期）: 2013,（4）
• 所属期刊栏目: 生物技术与方法
• 页码范围: 510-519
• 语种: 中文

摘要

传统的T载体克隆方法需要烦琐的后续步骤来筛选和鉴定重组子,并且无法实现目的基因的定向克隆.为了克服这些问题,本研究在pET-23a(+)的基础上构建了定向T载体pETG,首先通过定点诱变消除pET-23a(+)上的两个BfuⅠ位点得到PET-23aM；设计一对引物在5’端各引入一个BfuⅠ位点,下游引物紧邻BfuⅠ位点引入13 bp的部分LacO序列,用该引物从pHBM2002上扩增Prrn-gfp表达盒,插入PET-23aM的NdeⅠ和Xho Ⅰ位点,得到定向T载体pETG.PCR扩增的目的基因通过下游引物引入7 bp剩余的LacO序列,该基因片段与BfuⅠ酶切制备的定向T载体连接、转化大肠杆菌DH10β感受态细胞,通过补加了X-gal的平板筛选蓝色重组子.质粒酶切和PCR鉴定表明蓝色菌落全部为定向插入的重组子,重组效率100％,利用本方法成功地定向克隆了103个人类肝蛋白编码基因cDNA,克隆过程无需复杂的步骤筛选鉴定重组子.随机选择了其中的8个基因的克隆进行表达,结果显示8个克隆均在大肠杆菌中获得成功表达.该结果表明定向T载体构建成功,并且该载体非常适合基因的克隆和表达.