GST-NDPK-A融合蛋白的原核表达及体外互作蛋白的检测

• 作者: 刘忠 吕芬 张嘉萱 熊盛 赵振岭 钱垂文 银兴峰 陈伟 陈妙娟
• 来源期刊: 生物技术通报
• 关键词: NDPK-A Fussel-18 Rrp12 表达纯化 相互作用
• 年，卷（期）: 2013,（5）
• 所属期刊栏目: 研究报告
• 页码范围: 137-143
• 语种: 中文

摘要

旨在了解核苷二磷酸激酶A(NDPK-A)的功能,通过GST-Pull down技术寻找与其存在体外相互作用的蛋白.以含有目的片段的质粒pBV-NDPK-A为模板,扩增出相应的目的基因片段,将其插入带有GST标签的原核表达载体pGEX-4T-2,构建重组表达质粒.双酶切及测序鉴定正确后,转化至大肠杆菌BL21,经IPTG诱导,Glutathione Sepharose 4B亲和纯化,通过SDS-PAGE电泳及Western blot确定融合蛋白的表达,并与高表达细胞系A549孵育,进行GST-Pull down试验,并通过LC-MS/MS质谱鉴定体外与NDPK-A相互作用的蛋白.结果显示,成功构建GST-NDPK-A的原核表达载体；在大肠杆菌BL21中诱导表达出可溶性融合蛋白；经Glutathione Sepharose 4B纯化后,获得了有生物活性的GST-NDPK-A融合蛋白,GST-Pull down试验和质谱鉴定结果发现NDPK-A与Fussel-18、Rrp12体外存在相互作用.