N-乙酰胞壁质酶缺失对保加利亚乳杆菌LJJ自溶及形态的影响

• 作者: 刘鹭 吕加平 崔文明 张书文 李红娟 逄晓阳
• 来源期刊: 中国农业科学
• 关键词: 乳酸菌 基因敲除 自溶 N-乙酰胞壁质酶
• 年，卷（期）: 2014,（15）
• 所属期刊栏目: 贮藏?保鲜?加工
• 页码范围: 3058-3068
• 页数: 11页
• 语种: 中文
• DOI: 10.3864/j.issn.0578-1752.2014.15.015

摘要

乳酸菌自溶在发酵乳制品生产中广泛存在，自溶的速率和程度可以对产品的质量、风味、生产周期产生重要影响，在整个发酵过程中非常重要。N-乙酰胞壁质酶作为肽聚糖水解酶中的重要组成，可以破坏细胞壁完整性，在乳酸菌自溶过程中发挥着重要作用。论文旨在研究N-乙酰胞壁质酶缺失对保加利亚乳杆菌自溶的影响及对其形态的影响。分别以保加利亚乳杆菌基因组和pMG36e载体为参考序列设计引物，PCR分别扩增保加利亚乳杆菌中N-乙酰胞壁质酶的上下游同源臂基因m-up， m-down和pMG36e中的红霉素抗性基因。上述基因经过测序验证后，将经KpnΙ，XbaΙ双酶切的红霉素抗性基因和pUC19相连接形成重组载体pUC：Emr并进行验证。随后，将经Kpn Ι，Sac Ι双酶切的m-down和重组载体pUC：Emr相连接形成重组载体pUC：Emr：m-down并进行验证。最后，将经PstΙ，XbaΙ双酶切的 m-up与重组载体pUC：Emr：m-down相连接形成重组载体pUC：m-up：Emr：m-down并进行验证。以重组载体pUC：m-up：Emr：m-down作为N-乙酰胞壁质酶的同源重组敲除组件,在电转化条件电压1.5 kV，电阻400Ω和电容25μF下，电转入保加利亚乳杆菌，在含有红霉素的MRS琼脂平板上筛选N-乙酰胞壁质酶基因敲除突变菌株并进行PCR验证。采用核酸溶出法检测基因缺失菌株与野生型菌株间的自溶度变化。扫描电子显微镜观察基因缺失菌株与野生型菌株间的形态变化。构建得到在N-乙酰胞壁质酶中间插入红霉素抗性基因为筛选标记的敲除组件用于保加利亚乳杆菌中N-乙酰胞壁质酶的基因敲除。获得带有红霉素抗性基因的N-乙酰胞壁质酶缺失的保加利亚乳杆菌突变菌株。突变菌株相比野生型菌株自溶特性及形态均发生显著变化，其中自溶度显著降低，37℃下自溶24 h，野生型菌株的自溶度约为73%，而突变菌株的自溶度约为35%，自溶度降为原来的1/2。野生型菌株的单个菌体细胞长度约10μm，突变菌株的单个菌体细胞约30-40μm，相比野生型菌株约增长了3-4倍。N-乙酰胞壁质酶在保加利亚乳杆菌自溶与细胞分裂过程中起着重要作用。保加利亚乳杆菌中N-乙酰胞壁质酶的缺失会导致菌体自溶的降低和菌体增殖过程中的细胞分裂受阻，产生菌体长度增长约3-4倍的菌体细胞。