CD44基因RNA干扰慢病毒载体的构建与鉴定

• 作者: 向明亮 吴皓 沈晨凌 聂琛 胡海霞 马衍
• 来源期刊: 中国耳鼻咽喉颅底外科杂志
• 学科: 医学
• 关键词: 下咽癌 CD44 RNA干扰 慢病毒
• 年，卷（期）: 2014,（5）
• 所属期刊栏目: 论著
• 页码范围: 379-383,388
• 页数: 6页
• 分类号: Q784|R739.63
• 字数: 3458字
• 语种: 中文
• DOI: 10.11798/j.issn.1007-1520.201405001

摘要

目的 构建CD44基因RNA干扰(RNA interference,RNAi)慢病毒表达载体并在下咽癌FaDu细胞株上鉴定其沉默效率,为研究目的基因沉默后下咽癌肿瘤细胞致瘤性的改变提供稳定可靠的载体.方法 针对目的基因CD44 mRNA的序列,按照RNA干扰序列的设计原则,设计、合成4个CD44基因特异性小分子干扰iRNA(small interference RNA,siRNA)靶点,将其合成短发卡hRNA(short hairpin RNA,shRNA)并退火成双链DNA,与慢病毒载体重组形成shRNA表达载体,利用PCR和测序鉴定获取正确克隆.将筛选出的最有效重组载体与慢病毒包装质粒共转染293T细胞并测定病毒滴度.随后将其感染下咽癌FaDu细胞株细胞,采用Real-time PCR检测靶基因的沉默效率.结果 对LV-CD44-shR-NA载体进行双酶切鉴定,证实短发夹RNA正确插入慢病毒载体,DNA测序证实插入序列正确,CD44基因RNA干扰重组慢病毒载体经293T细胞成功包装后,其病毒滴度为8E+8TU/ml.RNA干扰下咽癌FaDu细胞CD44基因后,CD44 mRNA水平显著下降,干扰效率大于70％.结论 成功构建了CD44基因的shRNA慢病毒表达载体,能够在细胞水平有效沉默靶基因,为CD44基因沉默后下咽癌肿瘤细胞生物学改变的研究打下了较坚实的基础.