小鼠RNA干扰RelA基因慢病毒载体的构建与鉴定

• 作者: 孟蕾 张辉 李娟 李永明 杜沿林
• 来源期刊: 现代生物医学进展
• 学科: 医学
• 关键词: RelA基因 慢病毒载体 RNA干扰 成骨细胞
• 年，卷（期）: 2016,（17）
• 所属期刊栏目: 基础研究
• 页码范围: 3206-3211
• 分类号: Q78|R-33
• 语种: 中文
• DOI: 10.13241/j.cnki.pmb.2016.17.002

摘要

目的:构建小鼠RelA基因的RNA干扰慢病毒载体,转染小鼠成骨样细胞并鉴定.方法:针对小鼠RelA基因序列,设计特异性的shRNA序列,应用基因重组技术插入慢病毒载体GV-248.得到的重组质粒转化感受态大肠杆菌DH5α,筛选得到阳性克隆并扩大培养.所得质粒进行测序分析确定载体构建成功.重组质粒载体及包装辅助质粒转染293T细胞,得到目的病毒并测定相应病毒滴度.慢病毒转染MC3T3-E1细胞后,Real-time PCR及Western blot检测MC3T3-E1细胞RelA基因及成骨相关基因ALP、OCN、RANKL的表达.结果:成功构建小鼠RelA基因的RNA干扰慢病毒载体,感染MC3T3-E1细胞后,RelA基因的表达明显受到抑制,同时RANKL基因表达水平明显下降,ALP、OCN基因表达水平明显上升.结论:成功构建了小鼠RelA基因的RNA干扰慢病毒载体.当小鼠成骨细胞RelA基因表达被干扰,NF-κB通路被抑制后,小鼠成骨细胞成骨相关基因ALP、OCN的表达明显上升,成骨功能增强;同时RANKL的表达明显下降,其介导的破骨细胞骨吸收功能减弱.