小麦CWI-B1的原核表达、纯化与多克隆抗体制备

• 作者: 刘香利 曹汝菲 赵惠贤 黄传臻
• 来源期刊: 农业生物技术学报
• 学科: 农学
• 关键词: 小麦 细胞壁转化酶(CWI) 载体构建 原核表达 Western blot
• 年，卷（期）: 2017,（7）
• 所属期刊栏目: 研究资源与技术改进
• 页码范围: 1102-1110
• 页数: 9页
• 分类号: S512.1
• 字数: 6297字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.1674-7968.2017.07.007

摘要

细胞壁转化酶(cell wall invertase,CWI)催化质外体蔗糖水解形成源/库的糖浓度梯度,促进蔗糖不断地向库细胞卸出,在作物库强调节中起着十分关键的作用.为揭示小麦(Triticum aestivum)CWI在籽粒灌浆期的重要作用,本研究对己克隆的小麦细胞壁转化酶基因(TaCWI-B1)进行了生物信息学分析,并利用TaCWI-B1的编码区构建了原核表达载体pET28a-TaCWI-B1,转化大肠杆菌(Escherichia coli) BL21(DE3)菌株后对异丙基硫代半乳糖苷(isopropyl3-D-1-thiogalactopyranoside,IPTG)诱导浓度、培养温度和培养时间进行了摸索;利用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamidegel electrophoresis,SDS-PAGE)分析重组蛋白可溶性,利用镍柱分离纯化蛋白后通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF-MS)对重组蛋白进行鉴定、制各抗体,并对抗体的效价和特异性进行分析.结果表明,TaCWI-B1 cDNA序列总长l 845 bp,ORF长度1 776 bp,编码591个氨基酸的亲水性蛋白,理论分子质量65.92 kD,理论等电点pI 9.26;对重组蛋白进行建模和Mascot分析结果表明,TaCWI-B1是小麦细胞壁转化酶;重组蛋白最佳诱导表达条件为IPTG浓度0.2 mmol/L,28℃诱导6 h;His-tag融合的重组蛋白以包涵体形式大量表达;重组蛋白多克隆抗体酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)结果表明,抗体效价达1∶50 000以上,Western blot结果显示,制备的多克隆抗体不仅可以特异识别重组蛋白,而且能特异识别小麦叶片中的TaCWI-B1;这表明所制备的抗体具有很好的特异性,为TaCWI-B1基因的表达检测及功能研究提供了理论依据.

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	刘香利	西北农林科技大学生命科学学院	11	102	6.0	10.0
2	黄传臻	西北农林科技大学生命科学学院	1	6	1.0	1.0
3	曹汝菲	西北农林科技大学生命科学学院	1	6	1.0	1.0