牛冠状病毒核衣壳蛋白原核表达及鉴定

• 作者: 刘贤侠 陆亚冬 陈创夫
• 来源期刊: 新疆农业科学
• 学科: 农学
• 关键词: 犊牛冠状病毒 N基因 载体构建
• 年，卷（期）: 2018,（6）
• 页码范围: 1154-1165
• 页数: 12页
• 分类号: S855
• 字数: 8694字
• 语种: 中文
• DOI: 10.6048/j.issn.1001-4330.2018.06.019

摘要

[目的]诊断致犊牛腹泻冠状病毒.[方法]采集石河子、沙湾、奎屯等10个规模化奶牛场141份腹泻犊牛粪样,采用酶联免疫吸附实验(ELISA)进行冠状病毒检测,PCR方法进行核酸复检.同时根据GenBank登录的牛冠状病毒N基因序列,设计特异性引物,对Mebus分离株N基因进行扩增,克隆到PMD 19-T载体后,将测序正确的基因片段经EcoRI和HindⅢ双酶切后连接到PET-28a和PET-32a载体中,构建重组表达载体PET-28a-N和PET-32a-N,进行测序,亚克隆入BL21(DE3)表达载体,用IPTG进行诱导重组菌,SDS-PAGE和Western blot分析表达产物.[结果]所采集141份腹泻犊牛粪便中,用ELISA检测阳性率70.21％;再用RT-PCR检测出阳性率为61.7％同时,克隆了牛冠状病毒N基因,片段大小为1 400 bp,双酶切鉴定目的条带正确,测序结果与标准序列的进行比对同源性达到98.22％,通过SDS-PAGE分析证实表达的重组蛋白PET-28a-N-DE3相对分子质量为54KD;重组蛋白BCV-32a-N-DE3相对分子质量为70KD,Western blot分析表明该重组蛋白BCV-32a-N-DE3和BCV-28a-N-DE3和可以与牛冠状病毒阳性血清发生特异性反应.[结论]犊牛冠状病毒是导致石河子、沙湾、奎屯等10个规模化奶牛场和部分肉牛场犊牛腹泻的主要病原;ELISA方法和RT-PCR方法结合应用检测犊牛冠状病毒效果具有参考意义.获得的牛冠状病毒N蛋白具有很好的免疫反应性,为牛冠状病毒诊断试剂研发奠定基础.

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	刘贤侠	石河子大学动物科技学院	123	374	9.0	11.0
2	陈创夫	石河子大学动物科技学院	192	732	14.0	17.0
3	陆亚冬	石河子大学动物科技学院	6	7	2.0	2.0