利用酵母同源重组系统快速构建柑橘叶斑驳病毒的侵染性克隆

• 作者: 周常勇 宋震 宾羽 崔甜甜 晏建红 李中安
• 来源期刊: 中国农业科学
• 关键词: 酵母同源重组 柑橘叶斑驳病毒 三元穿梭载体 侵染性克隆
• 年，卷（期）: 2018,（9）
• 所属期刊栏目: 植物保护
• 页码范围: 1695-1705
• 页数: 11页
• 语种: 中文
• DOI: 10.3864/j.issn.0578-1752.2018.09.007

摘要

[目的]构建柑橘叶斑驳病毒(Citrus leaf blotch virus,CLBV)中国分离株的侵染性克隆,为从分子水平解析其致病机理打下基础.[方法]以GeneArt?pYES1L Vector为模板,PYES2117F、PYES2117R为引物扩增含有酵母相关复制起始位点的片段pYES1L-2117,利用限制性内切酶Sac II单酶切双元载体DK1317-2并回收其大片段,利用In-Fusion HD Cloning Kit重组连接双元载体DK1317-2骨架和片段pYES1L-2117,得到可以在酵母-农杆菌-大肠杆菌中复制的三元穿梭载体pCY.以马铃薯X病毒(Potato virus X,PVX)全长cDNA侵染性克隆为模板,pCY-PVX-F、pCY-PVX-R为引物扩增PVX全长,采用限制性内切酶Stu I、Sma I酶切质粒pCY,采用醋酸锂转化法将获得的PVX基因组全长cDNA与线性化的pCY载体共转化酵母菌YPH501,通过同源重组获得PVX基因组全长cDNA克隆.通过农杆菌介导接种本生烟验证所构建克隆的侵染性,从而建立基于酵母同源重组的病毒侵染性克隆快速构建体系.在此基础上,以CLBV中国分离物(CLBV-HBYD)全长cDNA为模板,分段扩增其基因组,得到片段CLBV-1、CLBV-2;利用所建体系对CLBV-1、CLBV-2及pCY载体片段进行同源重组.得到重组质粒pCY-CLBV后,经农杆菌介导接种本生烟和锦橙幼苗,并利用RT-PCR和Northern blot检测其侵染性.[结果]建立了酵母-大肠杆菌-农杆菌的三元穿梭载体PCY,该载体全长10347 bp,含有酵母、农杆菌、大肠杆菌的复制位点,能在酵母-农杆菌-大肠杆菌稳定复制,可用于在酵母中通过同源重组快速构建病毒基因组全长cDNA克隆,也可用于通过农杆菌介导直接接种植物寄主.利用该体系获得了CLBV中国分离株的基因组全长cDNA克隆16个.随机选取1个克隆进行了序列测定(GenBank登录号:MG572236),其基因组全长8747 nt,包含3个开放阅读框(open reading frame,ORF),ORF1为5889 nt、ORF2为1089 nt、ORF3为1092 nt.全基因组序列比对显示,CLBV-HBYD与已登录的9个CLBV分离物的核酸序列一致性为79％—98％,其中与柑橘来源的EU857540一致性最高,为98％,与猕猴桃来源的JN983454、JN983455、JN983456和JN900477的一致性均为79％.在利用MEGA6软件构建的系统发育树上,CLBV-HBYD与柑橘来源的CLBV分离株聚为一簇,而猕猴桃来源的CLBV分离株聚为另一簇.将所获16个CLBV全长cDNA克隆转化农杆菌,以pCY空载体为阴性对照注射接种本生烟.接种20 d后,抽提RNA进行RT-PCR检测,结果表明11个克隆的接种植株检测出CLBV特异性条带;随机选取5个阳性克隆进一步进行了Northern blot杂交,结果显示pCY-CLBV 1、2、3、14、15接种的本生烟可以检测到CLBV特异性条带,而对照样本未检测到任何条带,表明这些克隆均为侵染性克隆.[结论]构建了基于三元穿梭载体pCY的酵母重组克隆体系,利用该体系获得了中国CLBV分离株的适于农杆菌介导接种的基因组全长cDNA侵染性克隆.

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	宋震	西南大学/中国农业科	9	48	3.0	6.0