CRISPR/Cas9介导获得用于分离双峰驼iPSCs的转染细胞系

• 作者: 刘雷雷 张全伟 张勇 李宗帅 李海江 杨洋 申培磊 贡继尚 赵兴绪
• 来源期刊: 农业生物技术学报
• 学科: 农学
• 关键词: 双峰驼 CRISPR/Cas9 诱导性多功能干细胞(iPSCs) Nanog基因 报告基因
• 年，卷（期）: 2019,（1）
• 所属期刊栏目: 研究资源与技术改进
• 页码范围: 180-190
• 页数: 11页
• 分类号: S824
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.1674-7968.2019.01.019

摘要

双峰驼(Camelus bactrianus)作为西北地区的濒危物种,其生理特性特殊,用途广泛.利用诱导性多功能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)对该物种的种质资源进行保护具有重要的应用价值.但传统分离鉴定iPSCs的方法较为复杂繁琐.为了对iPSCs进行快速高效的分离鉴定,本实验利用CRISPR/Cas9系统,参照双峰驼Nanog基因,在其终止密码子附近设计单链导向RNA (single guide RNA,sgRNA),成功构建了切割载体;以双峰驼全基因组为模板获得上、下游同源臂,并在两个同源臂之间连入两个报告基因绿色荧光蛋白基因(green fluorescent protein,GFP)和新霉素抗性基因(neomycin resistance,Neo),成功构建了表达载体.同时测得双峰驼胎儿成纤维细胞对于遗传霉素(geneticin,G418)的最小致死量.用表达载体与切割载体共转染双峰驼胎儿成纤维细胞,继续培养48 h后,用G418筛选两周;之后用不含G418的DMEM/F12完全培养基对药筛后的细胞进行扩大培养,成功获得了活力较高的稳定转染细胞系.本实验为验证在Nanog基因后定点敲入报告基因来正确筛选iPSCs提供了生物材料.