CRISPR/Cas9介导的猪IPEC-J2细胞CD13基因敲除细胞系的建立

• 作者: 刘莎莎 刘颖 张秀玲 徐奎 李奎 牟玉莲 王晓朋 赵海全 邱乙卿 魏迎辉
• 来源期刊: 畜牧兽医学报
• 学科: 农学
• 关键词: CRISPR/Cas9 细胞表面分化抗原13 IPEC-J2
• 年，卷（期）: 2019,（7）
• 所属期刊栏目: 遗传育种
• 页码范围: 1319-1327
• 页数: 9页
• 分类号: S828.2
• 字数: 5654字
• 语种: 中文
• DOI: 10.11843/j.issn.0366-6964.2019.07.001

摘要

旨在利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术制备CD13基因敲除的IPEC-J2(猪空肠上皮细胞系)细胞,揭示细胞表面分化抗原13 (cluster of differentiation 13,CD13)在肠道病原微生物感染肠道细胞中所起的作用.本研究在猪CD13基因第2外显子区域设计2个向导RNA(guide RNA,gRNA),命名为g3、g5,然后分别将g3和g5克隆到pX330-GFP和pX330-RFP载体骨架上,电转染IPEC-J2细胞,48 h后通过流式细胞术分选具有双荧光标记的细胞,培养并获得单克隆细胞,PCR扩增、测序,从而获得CD13基因纯合敲除的阳性细胞系.对获得的20个细胞单克隆进行PCR,并挑取部分克隆PCR产物测序,发现共有7个克隆发生了基因片段缺失,其中1个克隆为单等位基因片段缺失,3个克隆为双等位基因杂合片段缺失,3个克隆为双等位基因纯合片段敲除.本研究检测双等位基因纯合片段敲除细胞的蛋白表达水平,其结果显示,在该纯合敲除细胞中CD13蛋白几乎不表达,表明成功构建了CD13敲除的IPEC-J2细胞系.本研究获得的CD 13基因敲除细胞系为探究CD13在猪肠道病原微生物感染肠道细胞中所起的作用奠定了基础.