烟草NtGCN2的原核表达、纯化及多克隆抗体制备

• 作者: 张松杰 张松涛 李宁 赵棋 郝英辰 郭豪 龙月
• 来源期刊: 农业生物技术学报
• 学科: 农学
• 关键词: 烟草 GCN2 原核表达 蛋白纯化 多克隆抗体
• 年，卷（期）: 2019,（1）
• 所属期刊栏目: 研究资源与技术改进
• 页码范围: 170-179
• 页数: 10页
• 分类号: S572
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.1674-7968.2019.01.018

摘要

GCN2 (general control non-derepressible-2)磷酸化真核翻译起始因子(eukaryotic translation initiation factor 2α,eIF2α)而抑制蛋白的翻译,从而感知氨基酸的缺乏并对各种胁迫做出响应.为了深入研究烟草(Nicotiana tabacum) NtGCN2的功能,本实验构建了烟草NtGCN2全长和N端NtGCN2(1～437 aa)的原核表达载体pET 15b-NtGCN2和pCzn1-NtGCN2(1～437 aa),分别在大肠杆菌(Escherichia coli) BL21-CodonPlus-(DE3)-RIPL、BL21-CodonPlus-(DE3)-RPL和BL21 (DE3) Plys进行原核表达.Western blot结果显示,烟草NtGCN2全长和NtGCN2(1～437 aa)蛋白分别在大肠杆菌BL2 1-CodonPlus-(DE3)-RIPL和BL21(DE3) Plys中成功表达.其次,对NtGCN2全长蛋白的表达条件进行优化.结果显示,在16℃、0.5 mmol/L异丙基硫代半乳糖苷(isopropylβ-D-thiogalactoside,IPTG)、13h的诱导条件下,BL21-CodonPlus-(DE3)-RIPL的上清中获得了可溶的NtGCN2蛋白.采用阴离子交换柱Hitrap Q和Ni2+-NTA琼脂糖亲和层析对蛋白进行初步纯化.采用包涵体复性的方法获得较纯的NtGCN2和NtGCN2(1～437 aa)蛋白.其中,NtGCN2(1～437 aa)通过Ni2+-NTA琼脂糖亲和层析纯化后获得条带单一的纯蛋白.最后,利用获得的重组蛋白制备抗体,并对原核表达的NtGCN2全长和NtGCN2(1～437 aa)蛋白进行Western blot检测,结果表明制备的抗体均能有效识别NtGCN2蛋白.本研究实现了NtGCN2蛋白的原核表达和纯化,制备了NtGCN2的多克隆抗体,为进一步探讨植物GCN2的功能提供了基础资料.