牦牛EPF的原核表达及多克隆抗体制备

• 作者: 曹艳桃 樊江峰 余四九 周应聪 杜培岩 李一娟 马进彪 赵生贤
• 来源期刊: 畜牧兽医学报
• 学科: 农学
• 关键词: 牦牛 早孕因子(EPF) 原核表达 多克隆抗体
• 年，卷（期）: 2022,（2）
• 所属期刊栏目: 生物技术与繁殖|ANIMAL BIOTECHNOLOGY AND REPRODUCTION
• 页码范围: 470-480
• 页数: 11页
• 分类号: S823.85.3|S852.4
• 语种: 中文
• DOI: 10.11843/j.issn.0366-6964.2022.02.014

摘要

本试验旨在制备牦牛早孕因子(early pregnancy factor,EPF)多克隆抗体,为牦牛妊娠早期高效快速诊断技术研究奠定基础.采用RT-PCR方法,从牦牛胎盘和卵巢组织中提取RNA,反转录为模板后进行EPF基因扩增,并将其克隆到改造后的载体pET28-His10-Sumo上,构建pET28-His10-Sumo-EPF重组质粒,经PCR和测序鉴定后将阳性重组质粒转化至感受态大肠杆菌BL21(DE3)中.用IPTG诱导表达并优化表达条件,使用His标签镍柱纯化重组EPF蛋白并免疫小鼠制备抗体.结果 显示,经PCR扩增的牦牛EPF基因在300 bp左右,符合预期结果,并通过测序验证获得重组阳性质粒.pET28-His10-Sumo-EPF重组质粒转化后经IPTG的诱导,表达分子质量大小为29 ku的蛋白(其中包括早孕因子目标蛋白和SUMO标签蛋白),且在37℃、IPTG浓度为300 nmol· L-1、诱导6h时获得最高表达量.Western blot结果显示,蛋白在上清和包涵体中均有表达,免疫后的小鼠抗血清能够与纯化后的重组蛋白发生免疫反应.本试验通过原核表达系统成功表达了重组牦牛EPF蛋白,制备了免疫原性较好的鼠抗EPF多克隆抗体.