DNA-PKcs单链抗体DPK3-scFv的原核表达纯化及生物学作用研究

• 作者: 刘晓丹 周丽君 周平坤 尚增甫 李兵 杨天一 汪思应 王豫 邢小翠 郑红
• 来源期刊: 军事医学
• 学科: 生物学
• 关键词: 单链抗体 原核表达 DNA-PKcs 电离辐射 磷酸化
• 年，卷（期）: 2012,（3）
• 所属期刊栏目: 论著
• 页码范围: 186-191
• 分类号: Q78
• 字数: 4712字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.1674-9960.2012.03.006

摘要

目的 原核表达和纯化DNA依赖性蛋白激酶催化亚单位(DNA-dependent protein kinase catalytic subunit,DNA-PKcs)单链抗体DPK3-scFv,观察其透入细胞及干扰辐射诱发DNA-PKcs磷酸化修饰的生物学作用.方法 PCR扩增DPK3-scFv基因,插入到带有His标签的原核表达载体pET28a,重组质粒转化工程茵BL21、优化表达.免疫荧光显微镜和蛋白免疫印迹观察DPK3-scFv透膜进入HeLa细胞及对电离辐射诱发靶分子DNA-PKcs的磷酸化修饰的影响.结果 成功构建单链抗体表达载体pET28a-DPK3-scFv,在2xYT培养基(16 g胰蛋白胨、5 g酵母提取物和lO g NaCI溶于1 L双蒸水中,高压灭茵)、20℃温度、O.2 mmol/L异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside,IPTG)条件下诱导可溶性表达,进一步获得了纯化单链抗体.DPK3-scFv能体外抑制DNA-PKcs激酶活性,纯化的DPK3-scFv可跨膜进入细胞内,并与DNA-PKcs共定位在细胞核.DPK3-seFv对γ射线照射HeLa细胞中DNA-PKcs及其S2056位点(pS2056)的自磷酸化具有显著抑制作用.结论 通过优化条件获得了可溶性原核表达的DPK3-scFv单链抗体,具有抑制其靶分子DNA-PKcs的磷酸激酶活性.