带绿色荧光蛋白标签的人细胞分裂周期蛋白25同源蛋白的真核表达及其生物学功能研究

• 作者: 丁丽华 叶棋浓 吕锦晶 宋良文 张浩 徐天昊 徐小洁 杜楠 程龙 范忠义 蒋凯
• 来源期刊: 生物技术通讯
• 学科: 生物学
• 关键词: 人细胞分裂周期蛋白25同源蛋白C 真核表达 显性负性作用 细胞周期
• 年，卷（期）: 2012,（2）
• 所属期刊栏目: 研究报告
• 页码范围: 162-165
• 分类号: Q78
• 字数: 3331字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.1009-0002.2012.02.003

摘要

目的:构建带增强型绿色荧光蛋白(EGFP)标签的人细胞分裂周期蛋白25同源蛋白C(cdc25c)基因的真核表达载体pEGFP-cdc25c,并检测其在人胚肾293T细胞中的表达定位情况及生物学功能.方法:采用PCR技术从实验室已有质粒中扩增人cdc25c基因,并将其克隆到pEGFP-C1载体中；将重组质粒转染人胚肾293T细胞,Western印迹检测转染细胞的表达情况,荧光显微镜观察cdc25c蛋白在细胞中的定位,并利用cdc2 Tyr15位特异性抗体验证EGFP-cdc25c作为磷酸酯酶的生物学功能.结果:双酶切和测序鉴定表明,pEGFP-cdc25c真核表达质粒构建成功；转染293T细胞后获得表达,在荧光显微镜下,表达阳性的细胞呈绿色,并定位于细胞质；Western印迹结果表明,EGFP-cdc25c能增加cdc2 Tyr15位的磷酸化水平,起到拮抗内源性cdc25c的功能.结论:构建了带EGFP标签的人cdc25c基因真核表达载体,该载体能够在哺乳动物细胞293T中表达,表达产物定位于细胞质；EGFP-cdc25c能够发挥显性负性作用,为深入研究cdc25c的生物学功能奠定了重要基础.