建鲤重组Cystatin蛋白的原核表达、鉴定及多克隆抗体制备

• 作者: 刘玲 张舒岩 李新 李松 李树红 李树蕾 杨立彬 金羽 陈秀华
• 来源期刊: 吉林大学学报（医学版）
• 学科: 生物学
• 关键词: 半胱氨酸蛋白酶抑制剂 原核表达 多克隆抗体
• 年，卷（期）: 2014,（1）
• 所属期刊栏目: 方法学
• 页码范围: 204-209,后插4
• 页数: 7页
• 分类号: Q78
• 字数: 4514字
• 语种: 中文
• DOI: 10.7694/jldxyxb20140144

摘要

目的:对建鲤半胱氨酸蛋白酶抑制剂(CPIs) Cystatin进行原核表达和纯化鉴定,并以重组Cystatin为抗原制备多克隆抗体.方法:用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导转入pET 30a Cystatin的E.coliBL21 (DE3)表达重组蛋白,经过Ni2+-NTA镍离子亲和层析纯化重组Cystatin,高效液相色谱鉴定重组Cystatin的纯度,Azocasein法测定其对木瓜蛋白酶的抑制作用.利用QuickAntibody-Mouse5W快速佐剂和纯化的重组Cystatin免疫Balb/C小鼠获得抗血清,采用夹心ELISA法鉴定抗血清的效价,Western blotting和免疫组织化学法鉴定抗血清的抗原识别特异性.结果:原核表达的目的蛋白相对分子质量约20 000;镍亲和层析纯化后重组Cystain在SDS-PAGE上显示单一条带,纯度＞95％;Azocasein法检测,0.014 μg重组Cystain抑制木瓜蛋白酶活性达50％以上;ELISA夹心法检测获得的Cystatin抗血清效价达到1:512 000;Western blotting检测,转入pET-30a空质粒的全菌蛋白中未检测到Cystatin存在,而在转入pET-30a-Cystatin的全菌蛋白及纯化各步样品中均检测到Cystatin信号,且均为单一条带;免疫组织化学检测,建鲤各组织呈现不同强度的Cystatin阳性染色,抗血清中的多克隆抗体与原核和真核表达的Cystatin均特异性结合.结论:成功表达和纯化了建鲤Cystatin;获得含高效价多克隆抗体的Cystatin抗血清,具有高特异性和灵敏性.