灯盏花CHI基因的再克隆及其绿色荧光蛋白表达载体构建

• 作者: 严胜柒 何凤明 卢开阳 官会林 应宇翔 张云峰 木佳
• 来源期刊: 云南师范大学学报（自然科学版）
• 学科: 生物学
• 关键词: 灯盏花 查尔酮异构酶 绿色荧光蛋白 表达载体
• 年，卷（期）: 2016,（3）
• 所属期刊栏目: 生物学
• 页码范围: 53-60
• 页数: 8页
• 分类号: Q785
• 字数: 4975字
• 语种: 中文
• DOI: 10.7699/j.ynnu.ns-2016-040

摘要

根据灯盏花转录组所注释的CHI unigene片段,设计了RACE相关引物,克隆到灯盏花CHI的cDNA全长序列,序列全长717bp,编码238个氨基酸.该氨基酸序列与我们前期所克隆的灯盏花CHI cDNA序列相比,在345、351位点发生了突变,碱基均由C突变为T,两个位点的突变均属于同义突变,编码的氨基酸分别为115、117位异亮氨酸、酪氨酸.同时将CHI基因片段插入到pDM 18-T,构建pDM 18-T-eBCHI中间载体.经测序验证后,根据pBI121-EGFP图谱,设计带有SalI、SpeI酶切位点的引物,以pDM 18 T-eBCHI中间载体为模板,扩增带酶切位点的CHI序列,扩增产物经回收、纯化后与双酶切的pBI121-EGFP链接,构建了重组表达载体pBI121-EGFP-CHI,CHI基因插入植物表达载体pBI121-EGFP的6xHis组氨酸标签与GFP基因间.经SaiI、SpeI双酶切和PCR验证重组质粒,均能得到约750bp的目的片段,通过进一步测序证明,CHI基因已成功地连接到pBI1 21-EGFP-eBCHI中.采用电击转化法将重组质粒导入根癌农杆菌GV3101,用叶盘法转化灯盏花叶片,筛选出具有卡那霉素抗性的愈伤组织,经PCR扩增和叶绿素荧光成像检测证明,重组基因已成功地转化到灯盏花愈伤组织中.为利用转基因技术研究CHI基因的表达及其亚细胞定位打下基础.