蛋白激酶R的原核表达、纯化及多克隆抗体制备

• 作者: 姜丽 姜水涛 孙晓林 张涛 朱鹏阳 李呈军 罗维玉 陈化兰
• 来源期刊: 甘肃农业大学学报
• 学科: 生物学
• 关键词: PKR 原核表达 蛋白纯化 多克隆抗体
• 年，卷（期）: 2016,（1）
• 所属期刊栏目: 动物科学·动物医学
• 页码范围: 7-12
• 页数: 6页
• 分类号: Q78
• 字数: 3793字
• 语种: 中文

摘要

[目的]构建蛋白激酶R的原核表达系统并制备其多克隆抗体.[方法]利用RT-PCR方法从人的A549细胞中扩增蛋白激酶R(PKR)基因,将其克隆到表达载体pGEX-6P-1中,经纯化后制备特展异性多克隆抗体.[结果]PKR基因经测序鉴定后转化宿主菌BL21 (DE3)感受态细胞,经终浓度0.5mmol/L IPTG诱导表达GST-PKR融合蛋白,SDS-PAGE分析表明融合蛋白获得稳定表达.表达产物经Glutathione-sepharose 4B亲和层析初步纯化后,用凝血酶切除GST标签,而后经离子交换层析及分子筛在AKTA Explorer上进一步纯化,得到高纯度无标签的PKR蛋白.以纯化后的PKR蛋白为抗原免疫新西兰白兔制备多克隆抗体,斑点杂交试验检测其效价达到1∶50 000以上,Western-blot和间接免疫荧光试验(IFA)表明制备的多抗与PKR蛋白的反应具有高度特异性.[结论]PKR蛋白在大肠杆菌中成功表达,且制备的多克隆抗体可用于PKR蛋白的检测,从而为研究PKR在病毒感染过程中的作用提供了重要的工具.