猪cGAS基因的克隆与原核表达

• 作者: 孙士平 李赛赛 杜丽丽 樊文杰 樊爽爽 王月影 王江 陈佩格 陈磊
• 来源期刊: 中国农业科学
• 关键词: 猪cGAS 非酶连接 丙酸诱导 原核表达
• 年，卷（期）: 2016,（9）
• 所属期刊栏目: 畜牧·兽医·资源昆虫
• 页码范围: 1803-1809
• 语种: 中文
• DOI: 10.3864/j.issn.0578-1752.2016.09.016

摘要

[目的]环磷酸鸟苷-腺苷酸合成酶(cyclic guanosine monophosphate-adenosine monophosphatesynthase,cGAS)是近期在哺乳动物细胞中发现的一种新型核酸转移酶,能够识别胞质DNA,催化ATP和GTP生成第二信使cGAMP,继而通过STING依赖的方式活化转录因子IRF3,启动机体固有免疫.通过构建含猪cGAS基因的重组质粒pBbB3a-His6-NusA-cGAS,进行原核表达,得到cGAS蛋白,为进行体外催化合成cGAMP及探讨其在天然免疫过程中的作用奠定基础.[方法]以猪脾脏cDNA为模板克隆猪cGAS的蛋白编码区(open reading frame,ORF),用非酶连接技术将此基因克隆至丙酸诱导型原核表达载体pBbB3a-His6-NusA-LIC中.菌液PCR进行阳性克隆鉴定并测序.将测序鉴定正确的克隆菌液提取质粒,转化至E.coli BL21 (DE3)中.当细菌生长到对数期时,丙酸钠诱导表达His6-NusA-cGAS融合蛋白,用20 mmol·L-1丙酸钠在20℃,180 r/min分别诱导0、2、4、6、8、10h,以确定最佳诱导时间;然后,分别用0、5、10、15、20、25、30、35、40、45 mmol·L-1的丙酸钠在20℃,180 r/min诱导6h,以确定最佳诱导丙酸钠诱导浓度;另外,分别在20℃,30℃,37℃条件下用20 mmol·L-1丙酸钠,180 r/min培养6h,以确定最佳诱导温度.筛选最佳诱导条件,并用SDS-PAGE和Western blotting进行鉴定.[结果](1)本试验成功克隆了猪cGAS基因,其ORF长度为1 494 bp;(2)构建了cGAS丙酸诱导型原核表达载体pBbB3a-His6-NusA-cGAS;(3) His6-NusA-cGAS融合蛋白在37℃,添加20 mmol·L-1丙酸钠,诱导6h时表达量最高.(4) His6-NusA-cGAS融合蛋白在裂解菌液的上清和沉淀中均有表达,相对分子质量为111.87 kD.[结论]运用大肠杆菌表达系统成功表达了cGAS融合蛋白,本试验为体外表达cGAS融合蛋白提供技术方法.