利用CRISPR/Cas9技术构建CREB基因敲除细胞系并探讨CREB对APP基因表达的调控作用

• 作者: 何文欣 刘昆梅 孙涛 崔建奇 张冰莹 石晓光 郭姗姗
• 来源期刊: 中国细胞生物学学报
• 关键词: CRISPR/Cas9 CREB 基因敲除 APP基因表达 阿尔茨海默病
• 年，卷（期）: 2017,（9）
• 所属期刊栏目: 研究论文
• 页码范围: 1147-1155
• 页数: 9页
• 语种: 中文
• DOI: 10.11844/cjcb.2017.09.0157

摘要

环磷腺苷效应元件结合蛋白(cAMP responsive element-binding protein,CREB)是重要的核转录因子,有研究表明,在阿尔茨海默病患者中,CREB的表达降低,但CREB对于淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein,APP)的作用机制尚不清楚.该研究通过设计sgRNA序列并合成相应的寡核苷酸,将其克隆到pX459质粒中,构建CREB基因敲除的CRISPR/Cas9二合一表达载体.将构建成功的载体转染到HT22细胞中,通过TA克隆测序和T7E1酶切分析来验证sgRNA的活性.将构建的载体转染到HT22细胞中,用嘌呤霉素进行药物筛选,构建稳定的CREB基因敲除的细胞系.CREB对APP基因表达的调控作用通过检测其在正常HT22细胞和CREB基因敲除的HT22细胞系中的表达情况来进行确认.结果显示,成功构建了CRISPR/Cas9技术对CREB基因进行敲除的二合一表达载体,所设计的sgRNA的插入序列和开放阅读框架完全正确,经过酶切分析和序列测定,所构建的载体与实验设计相一致.CREB基因敲除的HT22细胞系其敲除效率达到90％以上.通过Western blot分析检测CREB对APP表达的影响,结果发现,当CREB基因敲除后,APP表达增加,而过表达CREB时,则APP蛋白质表达水平下降.这提示,CREB对APP的表达有下调作用,具体的机制还将继续研究.

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	孙涛		130	457	12.0	15.0
2	刘昆梅		13	17	3.0	3.0
3	崔建奇		10	22	3.0	4.0
4	郭姗姗		1	0	0.0	0.0
5	张冰莹		1	0	0.0	0.0
6	何文欣		1	0	0.0	0.0
7	石晓光		1	0	0.0	0.0