ISG15蛋白泛素结合酶UBCH6的原核表达及多克隆抗体制备

• 作者: 冯佳佳 唐榕泽 李晓宁 李晓泉 李玉霄 梁晶晶 罗廷荣 高跃美
• 来源期刊: 动物医学进展
• 学科: 农学
• 关键词: ISG15蛋白 UBCH6基因 多克隆抗体 猪瘟病毒 蛋白诱导表达
• 年，卷（期）: 2020,（12）
• 所属期刊栏目: 研究论文
• 页码范围: 28-33
• 页数: 6页
• 分类号: S852.43|S852.651
• 语种: 中文

摘要

通过抽提接毒猪瘟病毒(CSFV)的PK-15细胞RNA,以RT-PCR方法克隆UBCH6基因,并与pMD18-T载体连接,再通过双酶切法将UBCH6基因与原核表达载体pGEX-4T-1、真核表达载体pcDNA3.0连接.重组原核表达载体pGEX-UBCH6用感受态细胞BL21转化,并在低温条件下,用低浓度的IPTG诱导表达UBCH6重组蛋白,经SDS-PAGE电泳和考马斯亮蓝染色结果显示,在30℃、用0.05 mmol/L IPTG诱导时UBCH6表达效果最好,而且UBCH6重组蛋白主要以可溶性的形式在菌液中表达.UBCH6重组蛋白经过Ni-NTA纯化后与弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂等体积混合乳化并免疫4周龄昆明小鼠,从而制备出UBCH6多克隆抗体,重组真核表达载体pcDNA3.0-UBCH6以化学转染人工脂质体法导入293T细胞中,Western blot检测制备的UBCH6多克隆抗体能与真核表达细胞蛋白发生反应,反应效价可达1:10000,反应性良好.Western blot检测UBCH6多克隆抗体的特异性,ISG15多克隆抗体、UBCH6多克隆抗体都能与接毒CSFV、转染PolyI:C的PK-15细胞蛋白发生良好反应,且蛋白表达量与时间呈正相关.