基于CRISPR/Cas9技术构建PKCα基因敲除的人腹膜间皮细胞系

• 作者: 吴忠财 马祖福 梁望群 左学志 姚颖 徐钢 王艻
• 来源期刊: 临床肾脏病杂志
• 关键词: 腹膜纤维化 PKCα CRISPR/Cas9 基因敲除
• 年，卷（期）: 2021,（9）
• 所属期刊栏目: 实验研究|EXPERIMENTAL STUDY
• 页码范围: 750-754
• 页数: 5页
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.1671-2390.2021.09.009

摘要

目的 通过CRISPR/Cas9技术敲除人腹膜间皮细胞系HM rSV5的PKCα基因,为腹膜纤维化的发病机制研究提供体外细胞模型.方法 针对人PKCα基因外显子区域设计3对sgRNA序列,其中两对序列靶点位于第4外显子,一对序列靶点位于第3外显子.由引物合成公司合成两端含酶切位点黏端的寡聚双链DNA,酶切连接至真核表达载体GV393.使用293T细胞进行慢病毒包装,通过病毒感染HMrSV5细胞,检测HMrSV5细胞中PKCα的敲除效率即脱靶情况.结果 3对sgRNA通过慢病毒表达载体成功转染HMrSV5细胞,经实时荧光定量PCR及免疫印迹检测两对sgRNA成功敲低PKCα.错配酶和基因测序结果显示PKCα基因组DNA导入有效突变,3个脱靶位点与原参考序列一致,排除脱靶情况.结论 利用CRISPR/Cas9技术成功构建了PKCα敲除的HMrSV5细胞,有利于相关基因体外研究.