LAG3慢病毒质粒构建及其稳定转染细胞系的建立

• 作者: 刘宇轩 黄莉莉 杨馥旭 方楷漪 胡楠楠 穆业腾 郭冲 夏薇 关新刚
• 来源期刊: 吉林大学学报（医学版）
• 学科: 生物学
• 关键词: 淋巴细胞活化因子3 慢病毒表达载体 红色荧光蛋白 细胞转染
• 年，卷（期）: 2022,（1）
• 所属期刊栏目: 基础研究|Research in basic medicine
• 页码范围: 136-141
• 页数: 6页
• 分类号: Q782
• 语种: 中文
• DOI: 10.13481/j.1671‑587X.20220117

摘要

目的:构建淋巴细胞活化因子3(LAG3)-mCherry红色荧光蛋白的LAG3-mCherry慢病毒表达载体,转染HEK293T细胞获得稳定表达LAG3-mCherry融合蛋白的细胞系,探讨LAG3-mCherry融合蛋白在HEK293T细胞中的定位.方法:将LAG3质粒和带有mCherry的慢病毒载体分别用限制性内切酶EcoRⅠ和NotⅠ进行双酶切,构建pEZ-LAG3-mCherry表达载体.将测序正确的质粒利用Lipofectamine 3000转染HEK293T细胞,利用荧光显微镜观察LAG3-mCherry在HEK293T细胞中的表达定位,Western blotting法检测LAG3-mCherry融合蛋白的表达情况.结果:酶切鉴定结果,电泳后重组质粒双酶切后可见约为8012和2066 bp大小的2条DNA条带,与pEZ-Lv-mCherry载体及LAG3基因片段大小相符;DNA测序结果,LAG3基因成功插入到慢病毒表达载体中.荧光显微镜观察,LAG3-mCherry融合蛋白主要在HEK293T细胞膜上表达,少量蛋白滞留在细胞质中.Western blotting法检测,在转染pEZ-LAG3-mCherry质粒中检测到LAG3对应特异性条带.结论:成功构建了LAG3-mCherry慢病毒表达载体pEZ-LAG3-mCherry.通过稳定转染成功制备了稳定表达LAG3-mCherry的细胞系.LAG3-mCherry融合蛋白主要分布于HEK293T细胞的细胞膜上.