真核表达质粒pVAX1-Der p 1的构建及在真核细胞中的表达

• 作者: 曹炜 曹瑞娟 许昱
• 来源期刊: 武汉大学学报（医学版）
• 学科: 医学
• 关键词: 屋尘螨 Der p 1 基因克隆 蛋白表达
• 年，卷（期）: 2011,（6）
• 所属期刊栏目: 基础医学研究
• 页码范围: 713-716,722
• 分类号: R762
• 语种: 中文

摘要

目的:构建真核表达质粒pVAX1-Der p 1，检测质粒编码的重组蛋白在真核细胞293T中的表达，为进一步的动物实验打下基础。方法:分离屋尘螨总RNA，根据GenBank已公布的Der p 1核酸序列设计引物，PCR扩增Der p 1编码基因，以其全长为目的基因，定向克隆至真核表达载体pVAX1，将其转化大肠杆菌DH5α，筛选含有重组质粒pVAX1-Der p 1的阳性克隆，培养后提取质粒并对其进行双酶切鉴定和序列测定及分析；应用Lipofectamine 2000脂质体转染剂，重组基因pVAX1-Der p 1和空质粒pVAX1分别转染真核细胞293T,采用细胞免疫荧光方法，以抗Der p 1特异性抗体检测质粒编码的重组蛋白在293T细胞中的表达情况。结果:获取的Derp 1基因与Genbank上Derp1cDNA全长序列完全一致，且构建的表达载体实现了目的蛋白的表达。结论:我国本土屋尘螨Der p 1序列与GenBank已公布的核酸序列完全一致；成功构建含Derp 1全长序列的真核表达质粒pVAX1-Der p 1，其能在真核细胞成功表达重组蛋白。