以双质粒逆病毒载体系统快速建立梯度过表达hMTA1稳转单克隆细胞系的方法

• 作者: 付明 刘健 孟希亭 常亚楠 张金龙 张雪燕 林晨 梁肖 王海娟 赵玫 钱海利 黄常志
• 来源期刊: 癌症进展
• 学科: 生物学
• 关键词: MTA1 GFP 逆病毒 稳转 梯度过表达 单克隆
• 年，卷（期）: 2012,（3）
• 所属期刊栏目: 肿瘤转移理论模型专栏
• 页码范围: 205-210
• 页数: 6页
• 分类号: Q78
• 字数: 4536字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.1672-1535.2012.03.002

摘要

目的 利用逆病毒表达载体快速构建梯度过表达人MTA1稳转单克隆细胞系.方法 利用噬菌斑原位杂交筛选人肺噬菌体文库,以阳性克隆为模板,RT-PCR获得人MTA1完整CDS序列.以逆病毒表达载体pMX为基础,经过多次酶切连接,构建逆病毒表达载体pMX-MTA1-flag-IRES-EGFP.将构建好的逆病毒载体系统,转染293-gag/pol细胞,包装出含该表达载体的逆病毒颗粒.以含病毒上清多次感染HCT116细胞,获得稳定转染MTA1的HCT116多克隆细胞系.将该多克隆细胞系按合适比例稀释后接种至10cm大皿,获得大量单克隆细胞系,以GFP为筛选标志,筛选不同荧光强度的单细胞克隆进行扩增并分析MTA1与GFP表达水平的线性关系.结果 测序结果显示成功克隆出人MTA1表达序列.免疫荧光、Western Blot结果证实成功构建出梯度过表达MTA1的稳转细胞系.相关性验证结果显示构建的非融合载体MTA1与GFP的表达呈明显的线性相关,相关系数r=0.932,P＜0.01.结论 利用逆病毒表达系统,快速成功构建并筛选出MTA1与GFP非融合梯度过表达稳转单克隆细胞系,为MTA1基因功能研究提供了良好模型.该逆转录病毒平台可用于快速建立其他基因的稳转单克隆细胞系.