ILK基因RNAi慢病毒表达载体的构建与鉴定

• 作者: 周立娟 徐振晔 王中奇 许玲 赵晓珍 龚亚斌
• 来源期刊: 中华肿瘤防治杂志
• 学科: 医学
• 关键词: 蛋白质丝氨酸苏氨酸激酶 慢病毒感染 肺肿瘤 基因表达
• 年，卷（期）: 2012,（24）
• 所属期刊栏目: 前沿报道/论著
• 页码范围: 1841-1844
• 分类号: R734.2
• 语种: 中文

摘要

目的:进一步研究整合素连接激酶(ILK)的功能,构建ILK基因RNAi慢病毒载体,并对其在肺腺癌A549细胞株中干扰效率进行鉴定.方法:针对ILK基因RNAi有效靶序列,合成4对oligo DNA,退火形成双链DNA,与经AgeI和EcoRI酶切的质粒pGCSIL-GFP载体连接产生shILK-LV慢病毒载体,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定,用shILKi-LV载体、pHelper 1.0载体和pHelper 2.0载体共转染包装细胞293 T细胞,包装产生慢病毒,以293 T细胞绿色荧光蛋白(GFP)的表达水平测定病毒滴度.获得重组慢病毒后感染人肺癌A549细胞,荧光显微镜观察GFP及Real-time PCR检测ILK在A549细胞中的表达.结果:PCR扩增出插入片段,测序证实成功构建了ILK-shRNA慢病毒载体shILKi-LV.包装并浓缩慢病毒,滴度分别为6×108、6×108、5×108和4×108 pfu/mL;将病毒感染A549细胞,荧光显微镜下观察80％细胞表达绿色荧光,Real-time PCR检测ILK mRNA表达明显下降,其中染shILKFKD-1的A549细胞中ILK2-△△Ct值为0.058,shILKi-KD-2、3和4的ILK2-△△Ct值分别为0.162、0.072和0.119,尤以ILKsiRNA-1抑制最明显.结论:成功构建shILKi-LV病毒载体并建立了A549-shILKi细胞模型,为ILK在肺癌信号转导通路中的研究提供了工作基础.

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	徐振晔	上海中医药大学龙华医院肿瘤科	118	796	17.0	24.0
2	许玲	上海中医药大学龙华医院肿瘤科	67	397	12.0	18.0
3	龚亚斌	上海中医药大学龙华医院肿瘤科	32	141	7.0	11.0
4	赵晓珍	上海中医药大学龙华医院肿瘤科	43	269	9.0	16.0
5	王中奇	上海中医药大学龙华医院肿瘤科	75	579	14.0	23.0
6	周立娟	上海中医药大学龙华医院肿瘤科	4	12	2.0	3.0