单端孢酶烯3-0-乙酰转移酶编码基因Tri101的原核表达及多克隆抗体制备

• 作者: 史建荣 吴季荣 徐剑宏 殷宪超 祭芳 董飞
• 来源期刊: 中国农业科学
• 关键词: 单端孢酶烯3-0-乙酰转移酶 Tri101 原核表达 多克隆抗体 小麦赤霉病
• 年，卷（期）: 2013,（16）
• 所属期刊栏目: 植物保护
• 页码范围: 3369-3376
• 语种: 中文
• DOI: 10.3864/j.issn.0578-1752.2013.16.007

摘要

[目的]克隆Tri101并通过原核表达获得纯化蛋白,通过免疫SPF大白兔获得高效价、高灵敏度的多克隆抗体,为Tri101蛋白及转Tri101作物的检测提供抗体基础.[方法]以禾谷镰刀菌(Fusarium graminearium)F3210为材料,PCR法获得Tri101并连接至表达载体pET29a(+),将重组表达载体转化大肠杆菌BL21 (DE3)后利用IPTG进行诱导表达.利用纯化表达产物制备多克隆抗体.[结果]SDS-PAGE分析结果表明,Tri101在大肠杆菌BL21(DE3)中得到表达,重组蛋白大小为50 kD左右,以包涵体形式存在.利用HisTrap亲和柱纯化重组蛋白,最佳咪唑洗脱浓度为200 mmol.L-1.采用烟草蚀纹病毒蛋白酶切除重组蛋白中的His标签,酶切产物经HisTrap亲和柱再次纯化后免疫SPF大白兔,制备多克隆抗体.经ELISA法检测抗体效价为1∶12 000,检测灵敏度为0.05×10-6μg·mL-1.Western blotting结果证明制备的多克隆抗体对Tri101具有较好的专一性.[结论]通过Tri101的克隆及原核表达,获得了纯化的融合蛋白,通过免疫动物制备了兔源多克隆抗体,可用于Tri101蛋白及转Tri101小麦的检测.