绿色荧光蛋白原核表达载体的构建

• 作者: 徐芳 李红民 步怀宇 潘红艳 董浩 赵佳 赵轶君
• 来源期刊: 华北农学报
• 学科: 生物学
• 关键词: 绿色荧光蛋白 原核表达载体 pMAL-c2X 筛选标记
• 年，卷（期）: 2013,（3）
• 页码范围: 73-76
• 页数: 4页
• 分类号: Q78
• 字数: 3529字
• 语种: 中文

摘要

为开发以绿色荧光蛋白（GFP）为基因的原核表达载体，根据 NCBI 基因序列设计引物，通过 PCR 扩增获得GFP 编码基因，经限制性核酸内切酶消化后将 GFP 定向克隆至原核表达载体 pMAL－c2X 中 malE 基因下游的 EcoRⅠ与 Hind Ⅲ位点之间，与 malE 基因融合为一个表达框。重组产物转化 E．coli TB1感受态细胞，在添加有50 mg/mL AMP、10μmol/L IPTG 的 LB 平板上于37℃培养12～16 h 后放置于25～30℃的培养箱中继续培养4～6 h，365 nm UV 照射下挑取转化克隆，经扩大培养后用 IPTG 诱导 GFP 的表达并用 SDS－PAGE 检测表达效率。结果表明，融合在麦芽糖结合蛋白下游的 GFP 编码基因可以在宿主细胞中有效表达，在365 nm UV 照射下，可以直接从加有50 mg/mL AMP、10μmol/L IPTG 的 LB 平板上挑取发绿色荧光的重组克隆，SDS－PAGE 分析结果显示其扩大培养物经 IPTG 诱导后可高效表达 GFP。该结果为进一步构建以 GFP 为标记基因取代抗生素筛选标记的原核表达载体提供了切实的试验依据。