pCMV6-Entry p62真核表达质粒构建及高表达稳定细胞系的建立

• 作者: 吕琪 孙志广 宋月英 王成艳 秦晓静 闫玉仙
• 来源期刊: 武警后勤学院学报（医学版）
• 学科: 医学
• 关键词: p62/SQSTM1 自噬受体 真核表达质粒 MCF-7
• 年，卷（期）: 2014,（4）
• 所属期刊栏目: 论著
• 页码范围: 277-280
• 页数: 4页
• 分类号: R393
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.2095-3720.2014.4.001

摘要

[目的]构建pCMV6-Entry p62真核表达质粒,并将其转染至人乳腺癌细胞株MCF-7中,通过抗生素筛选构建高表达p62的稳定细胞系.[方法]以293ET细胞cDNA为模板,设计引物扩增p62基因片段,双酶切扩增出的目的基因片段及pCMV6-Entry Vector空载体,将酶切后的片段进行连接,转化构建质粒,酶切及测序验证；将构建好的质粒转染入MCF-7细胞株中,G418筛选稳定表达细胞株,并用实时定量PCR和Western blotting进行验证.[结果]酶切及测序结果证实成功构建pCMV6-Entry p62真核表达质粒；实时定量PCR结果显示,与对照组相比,转染p62的MCF-7稳定细胞中p62 mRNA的表达显著升高；Western blotting检测Flag及p62蛋白表达显示,在转染p62的MCF-7稳定细胞检在62 kd位置测到Flag阳性条带,对照组则没有阳性条带.在转染p62的MCF-7稳定细胞中p62蛋白的表达较对照组显著升高.[结论]成功构建了pCMV6-Entryp62真核表达质粒,并成功建立高表达p62的MCF-7稳定细胞系.