刚地弓形虫TgPRF的原核表达、多克隆抗体制备与应用

• 作者: 李威 李晶晶 田小军 谷俊朝 贾永根 邹洋 闫爱霞 黄敏君
• 来源期刊: 中国热带医学
• 学科: 医学
• 关键词: 刚地弓形虫 弓形虫前纤维蛋白 多克隆抗体 内参抗体
• 年，卷（期）: 2019,（7）
• 所属期刊栏目: 论著
• 页码范围: 634-637
• 页数: 4页
• 分类号: R382.5
• 语种: 中文
• DOI: 10.13604/j.cnki.46-1064/r.2019.07.08

摘要

目的 原核表达弓形虫TgPRF蛋白,制备多克隆抗体并评价其作为内参抗体的可行性.方法 以刚地弓形虫RH株速殖子cDNA为模板,PCR扩增TgPRF编码基因,克隆至pGEX-4T-1载体,转化至大肠埃希氏菌(Escherichia coliB L21.经IPTG诱导表达后,SDS-PAGE分析重组蛋白表达情况.利用GST标签亲和层析法纯化重组蛋白.以纯化后蛋白为抗原免疫新西兰大白兔,制备抗TgPRF多克隆抗体.收集弓形虫RH株速殖子,以制备的多克隆抗体为一抗,Western blotting检测抗体特异性及效价.收集ATc调控下不同时间点的弓形虫iKO-Ty-TgAPH虫株速殖子进行Western blotting,以抗Ty和抗TgPRF抗体为一抗,检测TgAPH和TgPRF表达量的变化.结果 SDS-PAGE显示:TgPRF在诱导4h后表达量趋于饱和,相对分子量为52 ku,且呈可溶性表达.弓形虫RH株速殖子总蛋白进行的Western blotting显示:抗TgPRF多克隆抗体可识别内源性的TgPRF,且该多克隆抗体稀释至1∶10 000时仍可见明显条带;iKO-Ty-TgAPH虫株速殖子总蛋白进行的Western blotting显示:TgAPH的表达量随ATc作用时间的增加呈递减趋势,而TgPRF表达量基本维持恒定.结论 本实验制备的抗TgPRF多克隆抗体特异性和效价良好,可作为衡量弓形虫特定蛋白表达量的内参抗体,也可直接检测内源性TgPRF的表达.