稳定表达敲入增强绿色荧光蛋白标记的干扰素γ受体2基因Ifngr2的黑素瘤细胞系的构建与鉴定

• 作者: 周涛 李卫华 樊浩
• 来源期刊: 中国药理学与毒理学杂志
• 学科: 医学
• 关键词: 肿瘤 免疫治疗 干扰素γ 信号通路 黑素瘤细胞
• 年，卷（期）: 2020,（3）
• 所属期刊栏目: 论著
• 页码范围: 215-223
• 页数: 9页
• 分类号: R979.1
• 字数: 4337字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3867/j.issn.1000-3002.2020.03.007

摘要

目的 构建稳定表达敲入增强绿色荧光蛋白(EGFP)标记的干扰素γ(IFN-γ)受体2基因Ifngr2的黑素瘤B16细胞系,进行IFNGR2表达和功能调控研究.方法 首先应用http://chopchop.cbu.uib.no/网站设计引导RNA,使用分子克隆的方法构建基于CRISPR-Cas9和CRIS-PITCh(v2)的表达载体,并将2种载体使用LTX共同转染入B16细胞系,筛选单克隆.然后,应用基因组PCR、流式分析以及荧光显微镜技术,对基因敲入位置和基因表达进行分析鉴定.对阳性克隆E10和B4进行IFN-γ20 mg·L-1刺激48 h,分析IFN-γ下游靶基因的表达以检测阳性细胞系对IFN-γ的反应性.最后应用流式分析和实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测肿瘤坏死因子α(TNF-α)20 mg·L-1和奥沙利铂2 mmol·L-1处理3和48 h后,E10和B4细胞系Ifngr2和EGFP的表达.结果 基因组PCR及测序分析显示,PCR产物与预期一致,EGFP插入基因组正确位置.流式细胞分析及荧光显微镜观察分析,可看到绿色荧光峰值右移及绿色荧光,说明该细胞系正常表达EGFP.RT-PCR分析显示,IFN-γ刺激后,Cd274(PDL1)在阳性克隆E10和B4细胞中显著上调63和138倍,Psmb9显著上调2885和4616倍,上调幅度与B16母细胞相当,说明E10和B4细胞系具有正常的IFN-γ信号通路.流式细胞分析显示,TNF-α处理后,E10和B4细胞平均荧光强度由3845和4456上升到5720和5972;奥沙利铂处理后,E10和B4细胞平均荧光强度由3032和2786上升到4285和4179.RT-PCR分析显示,TNF-α刺激后,Ifngr2在B16,E10和B4细胞中分别上升11.40,9.31和21.39倍,EGFP在E10和B4细胞中分别上升2.50和5.37倍;奥沙利铂刺激后,Ifngr2在B16,E10和B4细胞中分别上升10.99,3.54和5.39倍,EGFP在E10和B4细胞中分别上升2.70和2.44倍.IFN-γ处理不能上调Ifngr2和EGFP的表达,因此绿色荧光强度反映了Ifngr2的表达.结论 成功构建稳定敲入EGFP标记的Ifngr2基因的黑素瘤细胞系,发现TNF-α和奥沙利铂可上调Ifngr2和EGFP的表达,表明该细胞系可用于IFNGR2表达和功能研究.

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	周涛		23	177	6.0	13.0
2	李卫华		7	13	2.0	3.0
3	樊浩		2	1	1.0	1.0