RHBDF2-shRNA慢病毒载体的构建和Neuro-2a-RHBDF2-shRNA稳转细胞系的建立

• 作者: 朱佩仪 李友 李胜男 邓福 陈吴海 陈少凤
• 来源期刊: 吉林大学学报（医学版）
• 学科: 生物学
• 关键词: RHBDF2 RNA干扰 慢病毒 HEK 293T细胞Neuro-2a细胞 稳转细胞系
• 年，卷（期）: 2019,（6）
• 所属期刊栏目: 基础研究
• 页码范围: 1224-1230,前插1
• 页数: 8页
• 分类号: Q343.37
• 字数: 5575字
• 语种: 中文
• DOI: 10.13481/j.1671-587x.20190606

摘要

目的:构建RHBDF2-shRNA慢病毒载体,建立Neuro-2 a-RHBDF2-shRNA稳转细胞系,并检测稳转细胞株中RHBDF2 mRNA和蛋白表达水平.方法:根据NCBI提供的RHBDF2基因序列,设计并合成针对RHBDF2基因干扰靶点的shRNA-oligo,退火后将其连接到经EcoR Ⅰ和AgeⅠ酶切的慢病毒载体FV067-RNAi-EGFP-Puro中,构建FV067-RHBDF2-shRNA慢病毒质粒,通过PCR筛选阳性克隆并测序鉴定.使用HEK293T细胞和Neuro-2a细胞作为实验材料,FV067 Vector作为对照组,FV067-RHBDF2-shRNA作为实验组.通过Lipofectamine 2000将FV067 Vector和FV067-RHBDF2-shRNA慢病毒质粒分别与慢病毒辅助质粒psPAX2和pMD2G共转染至HEK 293T细胞中,转染48 h收集并纯化慢病毒,分别将对照组FV067 Vector和实验组FV067-RHBDF2-shRNA慢病毒在感染复数(MOI)为50时感染Neuro-2a细胞,荧光显微镜下观察细胞中绿色荧光蛋白的表达,采用2mg·L-1嘌呤霉素筛选出RHBDF2基因稳定沉默的细胞系.实时荧光定量PCR法检测2组细胞中RHBDF2 mRNA表达水平,免疫印迹法检测2组细胞中RHBDF2蛋白表达水平.结果:PCR和测序,RHBDF2-shRNA慢病毒载体中的干扰序列与设计合成的RHBDF2-shRNA-oligo序列完全一致.FV067Vector慢病毒的滴度为5×108 TU· mL-1,FV067-RHBDF2-shRNA慢病毒的滴度为3×108 TU·mL-1.实时荧光定量PCR检测,实验组稳转细胞株中RHBDF2 mRNA表达水平比对照组降低了52.26％(t=11.44,P=0.007 6).免疫印迹法检测,与对照组比较,实验组RHBDF2-shRNA稳转细胞系中RHBDF2蛋白表达水平降低了47％(t=6.374,P=0.007 8).结论:成功构建了FV067-RHBDF2-shRNA慢病毒载体并建立了Neuro-2a-RHBDF2-shRNA稳转细胞系,且Neuro-2 a-RHBDF2-shRNA稳转细胞系中RHBDF2 mRNA和蛋白表达水平明显降低.

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	李胜男		3	2	1.0	1.0
2	陈少凤	广东医科大学附属医院神经病学研究所	3	2	1.0	1.0
3	李友		4	2	1.0	1.0
4	陈吴海	中国热带农业科学院农产品加工研究所	3	2	1.0	1.0
5	邓福	广东医科大学附属医院神经病学研究所	2	0	0.0	0.0
6	朱佩仪	广东医科大学附属医院神经病学研究所	2	0	0.0	0.0