新金色分枝杆菌CRISPR基因编辑技术的构建及其初步应用

• 作者: 林春 童丽珍 杨套伟 邵明龙 张显 徐美娟 廖祥儒 饶志明
• 来源期刊: 食品与生物技术学报
• 关键词: 新金色分枝杆菌 CRISPR 基因编辑 转录激活
• 年，卷（期）: 2021,（7）
• 所属期刊栏目: 研究论文|Research Article
• 页码范围: 50-58
• 页数: 9页
• 分类号: Q812
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.1673-1689.2021.07.006

摘要

新金色分枝杆菌Mycobacterium neoaurum JC-12是一株用于转化植物甾醇合成甾体激素类药物中间体的重要菌株,传统的基因编辑方法效率低、周期长、操作复杂并且需带入抗性标签.近期 CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)/Cas9系统在许多非模式菌株中成功应用为本研究提供了参考.作者结合非同源黏性末端连接(NHEJ)构建了应用于新金色分枝杆菌基因组编辑CRISPR-Cas系统,对Mycobacterium neoaurum JC-12基因组上催化雄甾-4-烯-3,17-二酮(AD)合成雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮(ADD)的3-甾酮-脱氢酶(KSDD)分别设计了敲除和转录激活的靶向sgRNA.结果显示成功敲除了ksdd基因并且突变菌株KSDD的酶活下降了 80％,突变株发酵96 h的AD产量比原始菌株提高了 30％,并且突变株未代谢产生ADD.转录调控结果显示,靶向-29位点相比于无靶向对照ksdd的转录水平下降了38％,而靶向-83位点和-141位点则对ksdd的转录水平分别提升了 2.24倍和3.23倍,同时对应的AD和ADD的产量在对-29位点激活时没有显著变化,而AD和ADD的产量在-83位点分别提升了 26％和25％,在-141位点分别提升了 29.5％和36％.以上研究为进一步对新金色分枝杆菌基因组水平的代谢工程改造提供了更便捷的方式.