N-乙酰-D-葡萄糖胺-2-差向异构酶基因的克隆及表达

• 作者: 卢利平 周俊波 杨海泉 樊游 沈微 陈献忠
• 来源期刊: 食品与生物技术学报
• 学科: 工学
• 关键词: N-乙酰-D-葡萄糖胺-2-差向异构酶 大肠杆菌 基因克隆 酶学性质 N-乙酰-D-神经氨酸
• 年，卷（期）: 2018,（9）
• 所属期刊栏目: 研究论文
• 页码范围: 1000-1007
• 页数: 8页
• 分类号: TQ920.1
• 字数: 5796字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.1673-1689.2018.09.015

摘要

N-乙酰-D-葡萄糖胺-2-差向异构酶(AGE)是合成N-乙酰-D-神经氨酸(Neu5Ac)的关键酶.该酶的高效表达是提高全细胞细胞催化法合成Neu5Ac的有效途径.根据集胞藻(Synechocystis sp.PCC 6803)AGE编码基因slr1975序列信息和大肠杆菌密码子偏好性,优化密码子并人工合成目的基因序列slr975-co.将该基因克隆到表达载体pET28a中,构建了重组大肠杆菌BL21 (DE3)/pET28-slr并实现了目的基因的诱导表达.SDS-PAGE分析表明,重组蛋白质的相对分子质量在43 000左右,与预期大小一致,纯化产物蛋白质质量浓度约为1.7 g/L.重组AGE的最适反应温度为42℃,最适反应pH为6.0.AGE对GlcNAc、ManNAc的Km值分别为39.0、46.5 mmol/L.以分别表达AGE和N-乙酰神经氨酸裂合酶(NanA)的重组大肠杆菌作为催化剂,以N-乙酰-D-葡萄糖胺为底物,实现了N-乙酰-D-神经氨酸的全细胞催化合成.结果表明,对AGE密码子进行优化实现了该基因在大肠杆菌中的高效表达,为全细胞催化法高效合成N-乙酰-D-神经氨酸奠定了坚实的基础.